Quel mécanisme pour la
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SPL
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Nous disposons désormais à la fois de la protéine SPL et de substrats potentiels de l’enzyme tous deux bien caractérisés, ce qui nous a permis d’effectuer des études enzymatiques. Deux objectifs majeurs ont été définis pour ces études. Le premier consiste en l’étude de la sélectivité de substrats de la SPL. Pour cela deux substrats ont été synthétisés (Partie II), le SPTpT et un oligonucléotide contenant le Photoproduit des spores. Le deuxième objectif est d’obtenir plus d’informations sur le mécanisme réactionnel de la Spore Photoproduct Lyase, et notamment de mettre en évidence les différents intermédiaires réactionnels.
Le mécanisme proposé par T.P. Begley (Mehl et al., 1999) et vérifié en partie par J.B. Broderick (Buis et al., 2006, Cheek et al., 2002) présenté en introduction nous a servi de point de départ pour tester les deux activités (corrélées) de l’enzyme, à savoir l’activité de réparation du Photoproduit des spores, et l’activité de réductolyse de la SAM.
Les observations in vivo de W.L. Nicholson sur le caractère essentiel de la quatrième cystéine ont orienté notre travail en particulier vers l’étude du rôle de ce résidu dans le mécanisme enzymatique. Pour cela, nous avons entrepris des études enzymatiques in vitro sur la protéine sauvage et la protéine mutée avec le substrat SPTpT, et l’oligonucléotide.
Chapitre 1 : Résultats
I. Activité et spécificité de la SPL sauvage de Bacillus subtilis
La première expérience réalisée avait pour but de savoir i) si la SPL purifiée et reconstituée est active et ii) si elle est bien spécifique de la réparation du SP au détriment des autres photoproduits. Pour cela, la SPL sauvage de B. subtilis a été incubée avec de l’ADN de thymus de veau contenant toutes les lésions des bases pyrimidiques à savoir : les CPD, les (6-4)PP, et le Photoproduit des spores (SP). La quantité de photoproduits après un temps d’incubation de 0 minute et 30 minutes d’incubation a été mesurée après hydrolyse enzymatique et analyse HPLC couplée à la spectrométrie de masse. La Figure 45 montre la quantité de photoproduits restant après 30 minutes. Aucune disparition significative des dimères CPD et (6-4)PP n’est observée (moyenne sur deux expériences). En revanche, quasiment la totalité des lésions SP disparaît après 30 minutes d’incubation. Ceci indique que notre préparation de SPL dont le centre fer-soufre a été reconstitué de façon chimique est active et confirme que l’enzyme est bien spécifique de ce photoproduit, comme cela a déjà été montré (Slieman et al., 2000b).
Figure 45 : Spécificité de l’activité de réparation du SP par la SPL.
Quantité de photoproduits restant (en %) après 30 min d’incubation de la SPL de B. subtilis avec de l’ADN de thymus de veau irradié et contenant les photoproduits CPD TT, TC et CT, (6-4)PP TT et TC. Conditions : 0,5 µg/µ L d’ADN (25 µg), 10 µM de SPL, 1 mM de SAM, 2 mM de DTT et 2 mM de dithionite dans du tampon Tris HCl 100 mM, KCl 200 mM, pH 8.
II. Activités de la SPL sauvage de Bacillus subtilis avec le SPTpT
II.1.
Cinétique de l’activité de réparation du Photoproduit des
spores
La réaction suivie par HPLC couplée à la spectrométrie de masse en tandem est présentée Schéma 42. Il s’agit de savoir si le SPTpT est substrat de la SPL sauvage de B.
subtilis, et le cas échéant, de connaître les paramètres cinétiques de l’enzyme vis-à-vis de ce substrat.
Schéma 42 : Réaction suivie par HPLC-MS/MS. Réparation éventuelle par la
SPL du SPTpT en TpT non modifié.
Le Photoproduit des spores sous la forme d’un dinucléoside monophosphate SPTpT (dont la synthèse est décrite dans la partie II) a été incubé avec la SPL reconstituée et contenant 3,8 à 4,2 nanomoles de fer et de soufre par nanomole de protéine (Partie I) en conditions d’anaérobiose dans les conditions décrites dans la partie Matériels et Méthodes III.5.1 (page 95). Typiquement, la protéine est mise en présence de tampon et de DTT, puis réduite par le dithionite. Ce réducteur à bas potentiel (-550 mV) permet de réduire le centre [4Fe-4S]2+ à l’état 1+. De la SAM est alors ajoutée. La réaction de réparation est déclenchée par l’ajout du substrat SPTpT. A différents temps d’incubation à 37°C en boîte à gants, des fractions aliquotes de 10 µL sont prélevées, immédiatement sorties de la boîte à gants et congelées dans l’azote liquide. Ces échantillons sont traités comme décrit dans le chapitre Matériels et Méthodes III.5.3. La disparition du SPTpT (temps de rétention Rt = 20 min) est suivie par HPLC-MS/MS en utilisant les transitions 545/447, 545/251 et 545/195, tandis que l’apparition de TpT (Rt = 26,6 min) est suivie grâce aux transitions 545/419 et 545/195. La Figure 46 montre la courbe de la conversion du SPTpT (●) en TpT (○) en fonction du temps ainsi que les chromatogrammes HPLC-MS/MS obtenus à 0 minute et à 60 minutes. Comme on peut le voir, en 60 minutes, le substrat SPTpT a complètement disparu et est totalement converti en produit TpT. Ces premiers résultats démontrent que le Photoproduit des spores
subtilis, et que notre préparation d’enzyme dont le centre [4Fe-4S] a été reconstitué est active de façon catalytique avec ce substrat, puisque 1 µM d’enzyme convertit 10 µM de substrat SPTpT. Il faut noter que lorsque la SPL est sous forme « apo », c'est-à-dire sans le centre [Fe-S], aucune activité n’est observée, de même que lorsque la SAM est absente.
Figure 46 : Réparation du SPTpT par la Spore Photoproduct Lyase de B. subtilis. A gauche :
Chromatogrammes HPLC-MS/MS de conversion du SPTpT (Rt = 20 min) en TpT (Rt = 26,6 min). A droite : cinétique de réparation du SPTpT (●) en TpT (○) par la Spore Photoproduct Lyase de B. subtilis.