Détermination du rôle de la cystéine 141 dans la réaction enzymatique

D’après les résultats précédents, nous pouvons émettre l’hypothèse que le thiol de la cystéine 141 soit un donneur d’atome d’hydrogène dans la dernière partie du cycle enzymatique. Pour vérifier cette hypothèse, nous avons effectué plusieurs expériences de marquage isotopique au deutérium, afin de suivre des transferts d'atomes de deutérium au cours de la réaction. Les deux expériences effectuées sont les suivantes :

- utilisation de la SAM deutérée en position 5', afin d’étudier le transfert de deutérium de AdoH vers le produit de la réaction. Selon notre hypothèse, on ne devrait pas observer de transfert ;

- marquage de la protéine avec du deutérium, de façon à étudier le transfert de deutérium de la protéine au(x) produit(s) de réaction. Selon notre hypothèse, nous nous attendons à observer une incorporation de deutérium sur le produit final de la réaction avec la SPL sauvage, mais pas avec la SPL mutée.

IV.1.

Transfert de deutérium par la S-Adénosylméthionine marquée

en position 5’

La faible quantité de TpT formé lors de l’incubation avec la SPL mutée indique non seulement que le donneur final majoritaire d’atome d’hydrogène est absent, mais aussi qu’un donneur minoritaire d’atome d’hydrogène est présent dans le milieu réactionnel, puisqu’un peu de TpT est tout de même formé (10 % de réparation). Un donneur potentiel pourrait être AdoH, comme le propose J.B. Broderick (Buis et al., 2006, Cheek et al., 2002). Afin d’éprouver cette hypothèse, nous avons utilisé de la S-Adénosylméthionine marquée au deutérium en position 5' (notée[5’-(2H)2]SAM ou AdoCD2Met) dans le test enzymatique.

L’état de deutération de la SAM a été vérifié par HPLC couplée à la spectrométrie de masse en mode SIM négatif (Single Ion Monitoring). Pour cela, les ions 399, 400, 401, 402 et 403 ont été suivis : 73 % de la SAM deutérée possède bien les 2 deutériums ([5’-(2H)2]SAM

m/z = 401), 18% de la SAM possède un seul deutérium et 9 % de la SAM ne possède aucun deutérium. La SAM deutérée a été utilisée pour effectuer le test enzymatique avec la SPL sauvage et la SPL mutée C141A en présence de SPTpT (Matériels et Méthodes III.5.1 et III.5.6). La formation d’AdoH ainsi que son état de deutération ont été suivis par HPLC- MS/MS en mode MRM positif (transitions 252/136, 253/136, 254/136, 255/136).

La production d’AdoH est observée, et notamment 70 % de la 5’-désoxyadénosine formée est sous la forme AdoCD2H (avec deux deutériums et un hydrogène), indiquant que sa

formation est due à l’arrachement d’un atome d’hydrogène, probablement du substrat car la disparition de SPTpT est observée, que ce soit avec la SPL sauvage ou la SPL mutée.

En parallèle, la quantité de TpT ayant incorporé un deutérium est mesurée par HPLC-MS/MS en mode MRM négatif. Les transitions utilisées sont résumées dans le Tableau 18. 545/195 545/419 546/195 546/419 546/420 M TpT et SPTpT M TpT M+1 TpT et SPTpT M+1 TpT deutéré en 5’ M+1 TpT deutéré en 3’

Tableau 18 : Transitions utilisées pour la détection de SPTpT (« M » m/z = 545), TpT (« M » m/z = 545) et TpT deutéré (« M+1 » m/z = 546).

Aucune différence n’est observée entre les ratios TpT/TpTdeutéré pour la protéine sauvage et le mutant (12,0 ± 1,3 % de TpT deutéré avec SPL sauvage, et 12,8 ± 2,2 % avec SPLBsC141A). La très faible proportion de TpT deutéré observé avec la SPLBsC141A ne

peut donc pas résulter d’un transfert de deutérium provenant d’AdoH. AdoH n’est donc pas le donneur final d’atome d’hydrogène.

IV.2.

Marquage de la SPL par du deutérium

IV.2.1.Principe de l’expérience et effet du marquage sur la cinétique

Les hydrogènes échangeables (cystéines, sérines, etc...) des SPL (sauvage et mutée) ont été échangés dans un tampon Tris-HCl préparé dans du deutérium 100% comme décrit dans Matériels et Méthodes III.5.5. Le Schéma 47 présente les différentes étapes de cette expérience. Des colonnes MicroBioSpin P6 (Biorad) ont été utilisées pour effectuer le changement de tampon. Elles ont été équilibrées comme indiqué par le fabriquant par 4 passages successifs de tampon deutéré Tris-HCl 100 mM, KCl 50 mM, pH 8. Ensuite, entre 20 et 50 µ L de SPLBs sauvage ou SPLBsC141A concentrées sont déposés sur le haut du gel et les colonnes centrifugées pour récupérer les protéines échangées. Une fraction aliquote de la solution d’enzymes échangées est conservée pour doser la quantité de protéines, ainsi que les quantités de fer et de soufre. La SPL ainsi échangée est diluée à la concentration souhaitée (entre 10 et 20 fois) dans le tampon Tris deutéré. Le test enzymatique est alors effectué comme indiqué dans la partie Matériels et Méthodes III.5.1, avec des tampons deutérés, l'eau remplacée par D2O et donc les solutions des réactifs préparées dans ces tampons. A différents

temps d'incubation (15, 60 et 120 minutes) pour l’étude cinétique ou à 60 minutes pour les études de transfert de deutérium, 10 µ L sont prélevés puis traités de la façon suivante : 5 µ L des échantillons sont dilués dans du TEAA 2 mM, puis congelés, lyophilisés et resolubilisés dans du TEAA 2 mM non deutéré, et ceci deux fois de suite. Cette étape est nécessaire afin de perdre les hydrogènes échangeables du SPTpT et des produits de réaction, notamment les NH de la base et OH des sucres, qui auraient été échangés dans le tampon deutéré. De cette façon, les deutériums incorporés seront uniquement ceux qui proviennent de la capture d'un deutérium par un intermédiaire réactionnel, et qui ne sont donc pas échangeables.

Les échantillons sont alors analysés par HPLC couplée à la spectrométrie de masse en mode SIM négatif (Single Ion Monitoring). Les ions suivis sont 544, 545, 546, 547 et 548 pour TpT et SPTpT (notés M-1, M, M+1, M+2 et M+3 par la suite), ainsi que 609, 610, 611, 612 (M-1, M, M+1, M+2 et M+3). Le suivi de l’ion M-1 sert à vérifier l’intégrité de SPTpT, TpT ainsi que de l’adduit SO2H.