A U ) t el (min) a)
Fig. A.2:Densité optique à 280 et 325 nm en fonction du temps d’élution.
pics de la zone (a) correspondent aux composés phénoliques accrochés aux protéines car ils ont les même temps d’élution que les pics mesurés à λ = 280 nm, sensible aux tryptophanes des protéines. Les pics de la zone (b) correspondent aux composés phénoliques libres. L’aire correspondant aux composés phénoliques accrochés est considérée sous la courbe aux temps d’élutions tel=8.61 min jusque tel=12.60 min et l’aire correspondant aux composés phénoliques libres est considérée sous la courbe aux temps d’élutions tel=12.60 min jusque tel=25.12 min. Le lot 2 est composé à 70 % en composés phénoliques accrochés et 30 % en composés phénoliques libres.
A.2 Solubilité de l’isolat
La solubilité de l’isolat de tournesol à 91% en fonction du pH est déterminée au LRGP par des mesures de chromatographie en phase liquide à haute pression (HPLC). L’isolat est dispersé dans l’eau osmosée à 5g/L. L’ajustement en pH est fait par ajouts de petits volumes d’acide chlorhydrique et d’hydroxyde de sodium concentré. La solution est agitée 20 min puis filtrée et mise dans l’éluant. La solubilité en fonction du pH est également déterminée par spectrométrie-UV (fig. A.3). Pour la mesure par spectrométrie-UV, les mesures sont effectuées dans des solutions tampons de force ionique 0.1 M aux pH 3 (tampon acétate), 5 (tampon citrate), 7 (tampon phosphate), 10 (tampon carbonate).
La figure A.3 montre l’absorbance du lot 2 à différents pH. Le trait vertical en pointillés symbolise la longueur d’onde 280 nm à laquelle l’absorbance est considérée pour calculer la solubilité. La solubilité obtenue est la même pour les deux protocoles excepté pour la solution tampon citrate à pH 3, qui semble réduire d’avantage la solubilité qu’une solution acide chlorhydrique au même pH. L’acide citrique étant un poly-anions, il a pu complexer une partie des protéines.
A. Caractérisation de l’isolat de tournesol à 91 % 174 300 400 500 600 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 Lot 2 , Tournesol 91% Citrate pH 3 Acétate pH 5 Phosphate pH 7 Bistrispropane pH 9 NaOH pH 10 A b s o r b a n c e (nm) a) 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0 20 40 60 80 100 Isolat total HPLC /Spectro-UV 91% S o l u b i l i t é ( % ) pH b)
Fig. A.3:a)Absorbance en fonction de la longueur d’onde de solution du lot 2 à différents pH (I = 0.1 M). b) Solubilité en fonction du pH, avec le lot 2 (pureté 91 %), par HPLC et spectrométrie-UV.
A.3 Rayons hydrodynamiques
Les rayons hydrodynamiques du lot 2 en solution sont évalués en utilisant les coefficients de dif-fusion obtenus par difdif-fusion dynamique de la lumière (DLS, section 2.1.3). Une solution protéique à 5 g/L d’isolat (lot 2, 91 %) préparée dans un solvant d’hydroxyde de sodium à 0.1 mM (pH 10.0) est utilisée. 10 -7 10 -6 10 -5 10 -4 10 -3 10 -2 0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 0.12 30° 40° 50° 60° 70° 80° 90° 100° 110° 120° 130° 140° g 2 ( ) -1 (s) a) Lot 2, 91% en protéines 10 6 10 7 10 8 10 3 10 4 10 5 b) Lot 2, 91% en protéines 5g/L ( s -1 ) q (m -1 ) q 2
Fig. A.4:a) Fonction d’auto-corrélation en fonction du temps de retard, ajustée par mono exponentielle, avec l’isolat à 91 % pour une solution à 5g/L.
b) Taux de décroissances Γ en fonction du vecteur d’onde q pour une solution préparée avec le lot 2. La figure A.4 (a) montre les fonctions d’autocorrélation à différents angles, ajustées par une expo-nentielle simple (eq. 2.13). L’incertitude relative sur les taux de décroissance obtenus est de 1 %. La modélisation d’une seule taille monodisperse suffit à ajuster nos mesures. On peut donc considérer que la solution à 5 g/L du lot 2 contient une seule taille avec une polydispersité très faible (< 0.02 par
A. Caractérisation de l’isolat de tournesol à 91 % 175 l’analyse des cumulants). La figure A.4 (b) montre les taux de décroissance obtenus par les ajuste-ments précédents (fig. A.4) en fonction du vecteur de diffusion q par une loi de puissance d’exposant 2, signature de processus diffusifs responsables des fluctuations d’intensité. Le préfacteur de la loi de puissance correspond au coefficient de diffusion, D = 20.5 ± 0.5 µm2/s. Le rayon hydrodynamique associé au coefficient de diffusion est RH=10±1 nm. Ce rayon hydrodynamique correspond à la di-mension maximale de la globuline hexamérique d’après la littérature [97] et a également été obtenue par d’autres expérimentateurs [84].
A.4 Température de dénaturation
Les globulines de tournesol sont connues pour avoir des températures de dissociation dépen-dantes du pH et de la force ionique de la solution. Comme les globulines d’autres végétaux [90], les hexamères de globulines peuvent se dissocier en trimère ou monomère. Il faut donc dfférencier la température de dénaturation qui correspond à la perte de structure secondaire et la température de dissociation qui correspond à la perte de structure quaternaire. D’après la littérature [81], l’héxa-mère de globuline se dissocie en monol’héxa-mères dénaturés autour de 90◦C et le trimère se dissocie en monomères non dénaturés autour de 60◦C [93]. Les albumines de tournesol ont une température de dénaturation proche de 110◦C. 50 100 -2.0 -1.5 -1.0 -0.5 H 5 H 3 H 4 NaOH pH10 100 g/L Lot 1 Lot 2 Q ( m W ) Température (°C)
Fig. A.5:Variation du flux de chaleur ∆Q en fonction de la température. Les solutions sont préparées à 100 g/L avec le lot 1 (pureté 85 %, traits en pointillés) et le lot 2 (pureté 91 %, traits hachurés).
La figure A.5 permet de comparer les proportions des formes trimériques et hexamériques dans les solutions d’isolat protéique à 100 g/L préparés avec les lots 1 et 2 dans un solvant d’hydroxyde de sodium dilué à pH 10 (I = 0.1 mM). Pour le lot 1, on observe un pic endothermique avec un mini-mum à 95◦C. pour le lot 2, deux pics endothermiques sont visibles, un leger pic avec un minimum à 67.1◦C et un pic plus abrupt avec un minimum à 94◦C. On observe que pour le lot 2 la dénaturation du trimère en monomère est visible (∆H4=0.6 J/g de protéines), contrairement au lot 1. Le pic de
A. Caractérisation de l’isolat de tournesol à 91 % 176 dissociation de l’hexamère obtenu avec le lot 2 est plus abrupt que celui issu du lot 1, avec une aire plus grande (∆H5=7.5 J/g de protéines pour le lot 2 et ∆H3=6.4 J/g de protéines pour le lot 1).
Bien que les deux lots de tournesol aint été effectués avec le même protocole de purification, le lot 2, plus pur, contient également une seul population extrèmement peu polydisperse. D’après les mesures de microcalorimétrie le lot 2 semble également contenir plus de protéines non dénaturés.