Protéines de réserve du colza

Le tourteau issu de la trituration des graines de colza est très riche en globulines 12S (aussi appe-lées cruciférines) et albumines de colza 2S (aussi appeappe-lées napines). Le tourteau contient entre 30 et 40 % de protéines [109]. 25 à 65 % de la fraction protéique sont des globulines de colza et 10 à 50 % de la fraction protéique total sont des albumines de colza, selon la variété de colza. Les fractions pro-téique restantes sont composées de prolamines, de glutélines et de segments polypeptidiques libres [85]. Après la production d’huile, le tourteau de colza est principalement à destination animale. Deux composants présents dans le tourteau ont limité son utilisation, le glucosinolate et l’acide érucique (fig. 1.28) [110].

Des troubles physiologiques ont été remarquées chez les animaux ayant une alimentation trop riche en glucosinolates et en acide érucique contenus dans le tourteau et l’huile de colza. Cela a conduit au développement d’une variété de colza produisant une faible quantité d’acide érucique et de glucosi-nolate, appelée "double zero" [112]. Pour cette variété, la norme de glucosinolates dans le tourteau est fixée à 18 µmol/g (www.info.agriculture.gouv.fr) et 2 % (w/w) d’acide érucique [113]. Lors de l’extraction des protéines, des composés peuvent rester accrochés aux protéines, comme l’acide phy-tique et les composés phénoliques comme l’acide sinapique, principal composé phénolique présent dans l’isolat de colza.

L’acide phytique contient six groupes phosphate (fig. 1.29 (a)). Dans l’eau, cinq protons sont

1. Motivations et état de l’art 46 ment dissociés (pKa = 1.9 − 2.4 − 3.2 − 5.2 − 6.3) et trois ne sont dissociable qu’à des pH basiques (pKa = 8.0 − 9.2 − 9.5) [114]. Cet acide se complexe avec les minéraux (cations calcium, magne-sium) et limite donc l’ingestion de ces minéraux par l’organisme. L’acide phytique [115], comme les composés phénoliques [112] se fixe également aux zones chargées positivement des protéines. Les isolats utilisés au cours de cette thèse sont issus d’une variété double zero.

1.3.3.1 Extraction

La purification des protéines de colza, comme celle des protéines de tournesol, peut se faire de différentes manières. Les purifications par précipitation micellaire et par variation de pH sont présentées sur la figure 1.30.

La figure 1.30 montre les étapes de purification du tourteau de colza. Le tourteau est initialement dégraissé et déphénolisé par mélange à l’hexane puis séché à l’air ventilé à 40◦C. Le tourteau est ensuite mélangé à une solution d’hydroxyde de sodium à pH 10 puis centrifugé à 10 000× g pendant 30 min. La phase surnageante est récupérée. La distinction des protocoles par précipitation micellaire ou par variation de pH intervient pour les étapes suivantes :

Pour extraire les protéines par précipitation micellaire, le surnageant est filtré par ultrafiltration, puis refroidi à 8◦C et centrifugé 10 000× g pendant 30 min. Le culot est récupéré, broyé puis lyophi-lisé. Il contient principalement des globulines et des albumines de colza mais peut ne contenir que des albumines si les pores des filtres sont suffisamment fins.

Fig. 1.30:Schéma des protocoles de purification des protéines de colza par précipitation micellaire (bleu) et par variations de pH (rouge). (Image [113])

1. Motivations et état de l’art 47 Pour extraire les protéines par variation de pH, le pH du surnageant est abaissé à 3.5 puis remonté jusqu’à 7.5. La fraction soluble contient principalement des albumines alors que le précipité contient principalement des globulines. La fraction soluble peut être purifiée par ultrafiltration et diafiltration avant d’être lyophilisé. Le précipité est récupéré, broyé puis lyophilisé [110].

Le protocole utilisé pour la purification de l’isolat de ce projet de thèse correspond à une extraction par pH acide et une purification mécanique par filtration et diafiltration.

1.3.3.2 Structures

Les globulines de colza, tout comme celles du tournesol, sont des héxamères de masse molaire comprise entre 300 et 350 kDa [119], avec un point isoélectrique à 7.2 [120]. L’héxamère peut se dissocier en trimère et monomère [97, 121]. De la même manière que pour les globulines de tourne-sol, les interactions entre les trimères formant l’hexamère de globulines de colza sont principalement de nature non convalentes [122], on peut donc suggérer un impact du pH et de la force ionique dans la formation et la dissociation des hexamères et trimères de globulines de colza, toutefois aucune étude sur la dissociation des globulines de colza n’a été trouvée. Le monomère contient une séquence peptidique acide, liée à une séquence peptide basique par un pont disulfure [123, 124]. D’après la composition de l’hexamère en acides aminés chargés au pH de l’eau (180 arginines, 72 lysines, 138 acides glutamique et 138 acides aspartique d’après la séquence primaire), la charge nette est de -6

Fig. 1.31:a) Structure de la globuline de colza hexamérique, obtenue par diffraction des rayons X par un cristal (Identifiants protein data bank : 3KGL) [116].

b) Structure de l’albumine de colza obtenue par résonnance magnétique nucléaire en solution (Iden-tifiants protein data bank : 1PNB [117]) . (Image [118])

1. Motivations et état de l’art 48 à pH 7 en considérant que les pKa des acides aminés libres sont identiques à ceux liés par liaisons peptidiques. Le monomère contient 44 % de feuillets β et 11 % d’hélices α et 45 % de séquence non structuré dans une solution à pH 7 [121]. Les globulines de colza hexamériques ont une température de dénaturation de 84◦C pour des pH de 7 à 10.

Les albumines de colza sont des monomères de 12.5 à 14.5 kDa avec un point isoélectrique à 10.7 [109]. L’albumine de colza contient deux chaînes peptidiques liées entre elles par deux ponts disulfures. La plus petite séquence peptidique contient deux cystéines [125] alors que la plus grande séquence peptidique contient six cystéines, deux d’entre elles forment des ponts disulfures avec la séquence peptidique courte, les quatre restantes forment deux ponts disulfures intra-moléculaires [126]. Les albumines de colza contiennent 24 à 27 % d’hélices α pour des pH de 3 à 10. La séquence non structurée représente 73 à 76 % de la séquence totale (fig. 1.31) [121]. La dénaturation des albumines est observée pour des températures autour de 100◦C [121]. De plus, des températures où l’albumine change de conformations ont été observées à 50◦C et 60◦C [121].

1.3.3.3 Propriétés fonctionnelles

Les propriétés tensio-actives d’isolats de colza plus ou moins riches en globulines et albumines ont été étudiées à l’interface air/eau [127].

La figure 1.32 montre l’évolution de la pression de surface à l’interface air/eau, sous compression d’un film monocouche d’albumines de colza (1), d’un mélange comprenant 70 % de globulines et 30 % d’albumines de colza (2) et de globulines de colza (3). Pour les albumines de colza (1), la pression de surface augmente à faible concentration de surface (1 m2/mg) alors que pour les globulines (3)

Fig. 1.32:Pression de surface en fonction de l’inverse de la concentration superficielle d’excès pour les albu-mines de colza (1), un mélange 70 % de globulines et 30 % d’albualbu-mines de colza (2), les globulines de colza (3), à l’interface air/eau. (Image modifiée de [127])

1. Motivations et état de l’art 49 la pression commence à augmenter à partir de 0.2 m²/mg. La pression de surface maximale est de 8 mN/m. Pour le mélange globulines/albumine et l’isolat de colza, la pression de surface augmente à partir de 0.5 m²/mg et atteint 22 mN/m. L’augmentation de pression de surface à faible concen-tration superficielle d’excès est liée à la couverture de surface, plus grande pour les albumines de colza que pour les globulines pour une même masse. Cela est attribué à la masse molaire des albu-mines (12.5-14.5 kDa)beaucoup plus basse que pour les globulines (300-350 kDa) que l’on peut lier à l’aire moléculaire des albumines à l’interface air/eau qui est de 23 nm2contrairement aux globulines de colza dont l’aire par protéine est trouvée à 144 nm2. L’augmentation de la pression de surface jusqu’à 22 mN/m pour le mélange globulines/albumines et les albumines montrent que ce sont les albumines qui guident le maximum de pression de surface. Cela est attribuée au grand nombre d’al-bumines à l’interface, devant celui des globulines [127].

Grâce à leur propriétés interfaciales, les albumines de colza montrent de bonnes propriétés mous-santes [128] et émulsifiantes [129]. L’étude présentée ici montre l’évolution temporelle du diamètre moyen des gouttes des émulsions obtenues à pH 4 (A), pH 7 (B) et pH 9 (C) avec les albumines de colza (carrés rouges), les globulines de colza (triangles jaunes), un isolat total de protéines de colza (ronds verts) et un isolat de soja (croix bleues). L’isolat de soja a été choisi comme comparaison car il est utilisé commercialement (fig. 1.33). Les tailles des gouttes restent stables exceptées pour l’isolat

Fig. 1.33:Diamètre moyen des gouttes d’émulsions obtenues à pH 4 (A), pH 7 (B) et pH 9 (C) avec les albumines de colza (carrés rouges), les globulines de colza (triangles jaunes), un isolat de protéines de colza (ronds verts) et un isolat de soja (croix bleues) pendant 7 jours. (Image [129])

1. Motivations et état de l’art 50

Fig. 1.34:Module élastique de cisaillement G0d’une solution protéique à 9 % (w/w), après gélification à 90◦C, avec le refroidissement de température, pour des solutions de pH 4 à 10 (γ = 2 %, f = 0.1 Hz). (Image [130])

total de colza où l’on observe une coalescence plus marquée à pH 4. D’après S. H. Tan et al. cela est dû au processus d’extraction alcalin de l’isolat qui a dénaturé les protéines contrairement à la purifi-cation des globulines et albumines où l’extraction a été effectuée à l’eau salée pour les globulines et l’eau pure pour les albumines. Le diamètre des gouttes produites avec les globulines de colza est plus bas que celui des albumines sur tous les pH utilisés, ce qui montre que les globulines de colza ont de meilleures aptitudes émulsifiantes que les albumines de colza. Pourtant, comme on l’a vue dans le paragraphe précédent, les albumines ont une aptitude tensio-active supérieur aux globulines pour nue masse donnée. L’aptitude émulsifiante n’est donc pas principalement due à l’aptitude tensio-active du composé. Les globulines de colza ont également de meilleures aptitudes stabilisantes que le soja pour les pH 4 et 7. Cela rend les globulines de colza potentiellement valorisables dans les procédés de formulation.

Les propriétés gélifiantes du tourteau de colza sont également étudiées [130].

La figure 1.34 montre le module élastique de cisaillement G0 après gélification à 90◦C, avec le re-froidissement de température, pour des solutions de pH 4 à 10. La solution est préparée à 9 % (w/w) de protéines. A tous les pH, exceptés aux pH extrêmes (4 et 10), la solution protéique gélifie. Les solutions préparées aux pH 5,6 et 7 montrent une faible augmentation de G0 avec le refroidissement. Cela suggère que les changements de conformations et les répulsions électrostatiques dues au pH acide vont limiter la gélification de la solution. Pour les solutions aux pH 8 à 10, le module élastique augmente franchement avec le refroidissement. Cela indique que les interactions attractives sont en suffisamment grands nombres devant les interactions répulsives pour former un gel. G0est maximale pour une solution à pH 8 ce qui est proche du point iso électrique des globulines de tournesol. Les interactions électrostatiques inter-protéiques sont minimisées à ce pH.

1. Motivations et état de l’art 51 Les propriétés emulsifiantes et gélifiantes ont également fait l’objet d’études. Les propriétés gé-lifiantes sont toutefois moins bonnes que celles obtenus avec des produits commerciaux comme le soja ou le lin [131]. Des mélanges avec d’autres composés permettent néanmoins d’aboutir à des propriétés fonctionnelles viables [132].