Globulines et albumines de tournesol

2.3 2.4 2.5 n 2 Isolat de blé pur à >99% Extrapolation

Fig. 2.24:Carré de l’indice de réfraction en fonction de la fraction volumique en gliadines dans le solvant acétique (pH 3.0). Ajusté (trait plein) et extrapoler à φ = 1 (pointillés).

de n2en fonction de φ a pour pente ^{∆ n2}

∆ φ =0.599. Par extrapolation à une fraction volumique φ = 1 on trouve que l’indice de réfraction de l’isolat est ngli=1.541, en accord avec la littérature [169].

2.2.3 Globulines et albumines de tournesol

2.2.3.1 Purification de l’isolat et préparation des solutions

Les globulines et albumines de tournesol sont extraites au Laboratoire Réactions et Génie des Procédés (LRGP, Romain Kapel, Odile Messieres) à partir de tourteaux de tournesol industriel.

L’extraction des protéines de tournesol a été réalisée à l’aide d’un réacteur agité d’un litre à 400 rpm. Les quantités appropriées de tourteau et d’eau osmosée ont été ajoutées afin de respecter un ratio de 1/9 w/w (solide/liquide). L’ensemble a été mélangé à température ambiante, pendant 30 min, à pH 7 et en présence de NaCl à 1 M. Une solution de NaOH 1 M a été utilisée pour ajuster et maintenir le pH à 7.

La séparation solide-liquide a été effectuée par centrifugation (Thermoscientific Lynx 6000 centri-fuge) à 15000× g et à température ambiante pendant 30 min. La phase aqueuse a été filtrée sur des

2. Méthodes expérimentales et matériaux utilisés 82 filtres plissés en cellulose (Fisherbrand). Au cours de cette étape, les albumines et globulines de tour-nesol ont été extraites ainsi que les autres composés hydrolsolubles (composés phénoliques libres, oses, osides, acides aminés et peptides libres. . . ).

Ces composés ont été éliminés par un procédé de purification par ultrafiltration. Ce procédé débute par une étape de diafiltration sur un pilote d’ultrafiltration Akta flux 6 (GE Healthcare Life Science) et d’une membrane Millipore de 3 kDa et 0.1 m2 de surface (Pellicon 2 mini, P2PLBCV01). La pression transmembranaire a été réglée à 1.75 bar et le débit d’alimentation à 1 L/min. 7 diavolumes (DV) ont été réalisés avec de l’eau ultra pure à 0.5 M de NaCl suivis de 3 DV avec de l’eau ultra pure et à pH 10. L’extrait purifié a été stocké à - 80◦C avant d’être lyophilisé (Shanghai Pharmaceutical Machinery Co., LTD type GZL-0.5)

Les deux lots d’isolat de tournesol nous sont fournis par le LRGP avec ce protocole d’extraction. La méthode Kjeldhal [170] a été utilisée pour déterminer la pureté en protéines des deux lots. Le lot 1 est pur à 85 % en protéines, les 15 % restants correspondent aux fibres cellulosiques (5 - 10 %), aux polyphénols, avec des traces de NaCl, de NaOH et d’eau. Ce lot a été utilisé pour toute l’étude concernant les protéines de tournesol. Le lot 2 est pur à 91 % en protéines, contient 9 % d’eau et les traces de composés phénoliques représentent moins de 1 %. Ce lot a été utilisé pour l’étude en volume.

Le choix du solvant est, comme pour les gliadines, obtenu suivant plusieurs contraintes : - Permettre la solubilisation d’une grande part de l’isolat.

- Garder une tension de surface proche de celle de l’eau.

L’isolat de tournesol est mélangé dans une solution d’hydroxyde de sodium à 0.1 mM (pH 10.0) sur roue d’agitation pendant 1 à 5 min. La solution passe ensuite à travers un filtre en ester de cellulose (CME 0.22 µm, Karl Roth). Afin d’améliorer la reproductibilité des mesures interfaciales, les so-lutions utilisées pour ces mesures proviennent d’une solution mère à 10 g/L et sont ensuite diluées jusqu’à la concentration voulue. Les solutions de plus fortes concentrations sont préparées avec une solution mère à 100 g/L suivant le même protocole.

2.2.3.2 Composition protéique de l’isolat

Les mesures par chromatographie d’exclusion stérique en phase liquide à haute performance (High Pressure Liquid Chromatography, HPLC) et l’électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de dodécylsulfate de sodium (SDS-PAGE) sont effectuées par le Laboratoire Réactions et Génie des Procédés (LRGP, Romain Kapel, Odile Messieres). Pour effectuer la chromatographie l’isolat est dispersé à 5 g/L dans une solution de composition identique à l’éluant :

- eau osmosée 55 % v/v - acétonitrile 45 % v/v

2. Méthodes expérimentales et matériaux utilisés 83 La détection optique se fait aux longueurs d’onde λ =280 nm et λ =325 nm. L’absorption d’un rayonnement à 280 nm est très élevée pour les protéines contenant des acides aminés ayant un noyau aromatique tel que le tryptophane, la tyrosine et la phénylalanine. Les doubles liaisons carbones pré-sentes dans ces acides aminés ont un fort coefficient d’absorbance à 280nm [171]. L’absorbance de l’isolat peut être lié à la concentration en protéines lorsqu’elles sont le seul composé absorbant à cette longueur d’onde. Les albumines de colza contiennent peu de tryptophanes ce qui contribue à limiter le signal détecté.

La longueur d’onde λ = 325nm est principalement absorbée par les composés phénoliques libres [172]. L’acide chlorogénique et caféique sont naturellement très présents dans la graine de tournesol, lui donnant cette coloration noire [173].

7 8 9 10 11 12 13 14 15 0 1 2 3 4 5 6 SDS PAGE => Lot 1 85% en protéines = 280nm (A) (B) D e n s i t é o p t i q u e ( A U ) t el (min) a)

Fig. 2.25:a) Densité optique à 280 nm d’une solution l’isolat de tournesol pur à 85 % en fonction du temps d’élution.

b) Electrophorèse des solutions A et B correspondant aux solutions récoltées aux temps d’élutions des zones A et B du graphique (a) 2.25. les valeurs 10 µL, 5 µL, 2.5 µL correspondent aux volumes de solution utilisés.

La figure 2.25 (a) montre l’HPLC obtenue avec l’isolat de tournesol pur à 85 % sondé à λ = 280 nm (tryptophane des protéines principalement). Les temps d’élutions des zones A et B correspondent aux temps pour lesquels les solutions A et B sont récupérées pour les mesures de SDS-PAGE (fig. 2.25 (b)). Les traits en pointillés correspondent aux limites des pics correspondant aux globulines et aux albumines. Par rapport d’aires et connaissant la pureté totale en protéines on peut estimer la proportion en globulines et albumines présentes dans l’isolat. Puisque les deux pics se recouvrent légèrement, les rapports d’aires ne donnent qu’une estimation. Pour le lot 1, l’aire correspondant aux globulines est considérée sous la courbe aux temps d’élutions tel=8.33 min jusque tel =10.34 min et l’aire correspondant aux albumines est considérée sous la courbe aux temps d’élutions tel=10.34 min jusque tel=14.60 min. L’isolat pur à 85 % est composé à 68 % en globulines et 17 % en albu-mines.

2. Méthodes expérimentales et matériaux utilisés 84 Pour confirmer que les pics correspondent aux globulines et albumines de tournesol une mesure de SDS-PAGE est effectuée (fig. 2.25 (b)). La zone A contient des composés de masses molaires qui, d’après la litterature correspondent aux globulines. La masse molaire à 50 kDa correspond au monomère de la globuline de tournesol qui est hexamérique à l’état natif soit 300 kDa, le composé à 37 kDa correspond à la chaîne acide du monomère, le composé à 26 kDa correspond à la chaîne basique du monomère [94, 98, 174]. La zone B contient des composés de masses molaires de 14 à 16 kDa qui d’après la litterature correspondent aux albumines de tournesol [100, 175, 176].

Afin d’estimer le rapport des composés accrochés et libres, une mesure à 325 nm est effectuée pour les deux lot d’isolats de tournesol. Les composés phénoliques accrochés aux protéines et les composés phénoliques libres n’ont pas exactement le même coefficient d’extinction molaire. De plus, le coefficient d’extinction molaire obtenu varie selon la méthode utilisée [172, 177]. le résultat des rapports d’aires est donc une simple estimation puisque nous considérons un coefficient d’extinction molaire constant pour les composés phénoliques accrochés et libres. La figure 2.26 montre l’HPLC

10 15 20 0 1 2 3 4 5 6 Polyphénols libres Lot 1 85% en protéines = 280 nm = 325 nm D e n s i t é o p t i q u e ( A U ) t el (min) Polyphénols accrochés

Fig. 2.26:Densité optique à 280 et 325 nm en fonction du temps d’élution.

obtenue avec l’isolat de tournesol pur à 85 % en protéines. L’aire correspondant aux composés phé-noliques accrochés est considérée sous la courbe aux temps d’élutions compris entre tel=8.04 min et t_el=14.76 min. L’aire correspondant aux composés phénoliques libres est considérée sous la courbe aux temps d’élutions compris entre tel = 14.76 min et tel =21.42 min. Le lot 1 comprend 86 % de composés phénoliques accrochés et 14 % de composés phénoliques libres.

2.2.3.3 Propriétés optiques de l’isolat en solution

L’indice de réfraction de l’isolat est déterminé dans une solution d’hydroxyde de sodium à 0.1 mM (pH 10.0) pour des fractions volumiques en protéines φ comprises entre 0 et 0.075 (section 2.1.1).

2. Méthodes expérimentales et matériaux utilisés 85 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.7 1.8 1.9 2.0 2.1