Signalisation apoptotique émanant des récepteurs de mort.

Dans ce chapitre, les principaux événements de la signalisation apoptotique seront essentiellement décrits pour le récepteur CD95.

I.2.3.2.1. La formation du DISC, l’activation et le rôle des caspases initiatrices 2, 8 et 10 dans la signalisation apoptotique émanant des récepteurs de mort.

Les DR sont caractérisés par la présence d’un domaine de mort (DD) permettant le recrutement de protéines adaptatrices et la transmission du signal apoptotique. Une étude de cristallographie a permis de proposer un modèle précis des mécanismes moléculaires précoces faisant suite à l’interaction de CD95L avec son récepteur. Ainsi, la liaison de CD95L sur CD95 permettrait de regrouper un nombre suffisant de récepteurs en les maintenant en conformation « ouverte », c’est-à-dire ayant le DD exposé. Ce rapprochement induit la formation d’interactions entre des domaines globulaires des différents trimères de récepteurs et le DD de CD95 serait alors disponible pour lier FADD qui stabiliserait les ponts entre récepteurs (Scott et al., 2008). L’interaction entre CD95 et FADD est homotypique puisque FADD contient un DD qui lui permet d’interagir avec le DD de CD95 (Boldin et al., 1995 ; Chinnaiyan et al., 1995). La protéine FADD est essentielle au développement embryonnaire et à l’apoptose DR3-médiée ainsi qu’à celle induite par CD95L (Zhang et al., 1998 ; Juo et al., 1999 ; Yeh, 1998). En effet, FADD permet le recrutement des pro-caspases initiatrices 8 (MACH/FLICE/Mch5) et 10 (FLICE2/Mch-4), via une interaction homotypique entre les DED (Death Effector Domain) présents sur la partie N-terminale de ces caspases et de

FADD (Boldin et al., 1996 ; Muzio et al., 1996 ; Vincenz & Dixit, 1997 ; Medema et al., 1997). L’ensemble forme un complexe protéique en quelques secondes, le DISC pour Death Inducing Signalling Complex, dont la formation est indispensable à l’émergence des signaux apoptotiques sous-jacents (Figure 8) (Kischkel et al., 1995 ; Scaffidi et al., 1998). Le DISC comprend également la protéine inhibitrice c-FLIP (Irmler et al., 1997) (cf. chapitre 1.2.7). La stimulation de DR4 ou DR5 induit également l’apoptose cellulaire via FADD et le DISC, également formé suite à la liaison de TRAIL sur DR4 ou DR5, dont la formation serait indispensable à l’induction d’apoptose par TRAIL (Schneider et al., 1997 ; Sprick et al., 2000 ; Bodmer et al., 2000 ; Kischkel et al., 2000).

Les caspases 8 et 10 activées au niveau du DISC sont capables de cliver et d’activer les caspases effectrices 3, 7 et 6 qui conduiront à la protéolyse de nombreux substrats et à la mort de la cellule (Fernandes-Alnemri et al., 1996 ; Muzio et al., 1997 ; Lavrik et al., 2003) . L’activation des caspases 8 et 10 au sein du DISC constitue donc une étape d’initiation cruciale de la voie apoptotique extrinsèque émanant des DR. En parallèle, les caspases 8 et 10 sont également capables de cliver la protéine Bid (Bcl-2 Interacting Domain) (Milhas et al., 2005 ; Li et al., 1998) ce qui participe à l’activation de la voie mitochondriale de l’apoptose

Figure 8. Formation du DISC et induction de l’apoptose. La liaison de FasL sous sa forme membranaire (mFasL) (a) ou d’un anticorps anti-Fas agoniste, oligomérisé par un anticorps secondaire, (b) induit le recrutement de FADD, la caspase 8, la caspase 10 et FLIP (cf. chapitre I.2.7) au sein d’un complexe protéique nommé le DISC. Les caspases 8 et 10 ainsi activées peuvent alors propager le signal apoptotique (Rieux-Laucat 2003)

(cf. chapitre I.2.4).

Selon le modèle d’activation des caspases dit de « dimérisation proximité induite », les pro-caspases initiatrices 8 peuvent s’autoactiver par clivage quand elles se trouvent regroupées en dimères, ce qui est le cas au sein du DISC (Salvesen & Dixit, 1999 ; Muzio et al., 1998). Toutefois, l’importance du clivage entre les deux sous-unités dans l’activation de la pro-caspase 8 reste très controversée. Ainsi, des expériences de dimérisation in vitro ont permis de mettre en évidence que, bien que des mutations des sites de clivages entre les domaines p20 et p10 de la caspase 8 réduisaient l’activité catalytique des homodimères, elles ne l’abolissaient pas. Ainsi, in vitro, des mutants non clivables peuvent être efficacement activés par dimérisation (Chang et al., 2003 ; Pop et al., 2007). D’autres études ont également permis de proposer que l’activation des caspases initiatrices 8 (mais également 9) requière leur dimérisation et que leur auto-clivage protéolytique serait un évènement secondaire résultant de la stabilisation de dimères actifs (Boatright et al., 2003 ; Pop et al., 2006 ; Donepudi et al., 2003).

A l’inverse, des études suggèrent que le clivage seul, en l’absence de dimérisation, pourrait permettre l’activation de la caspase 8 (Sohn, 2004 ; Murphy, 2004). Une étude plus récente de reconstitution du DISC in vitro suggère qu’une forme de caspase 8 non clivable ne peut pas être efficacement activée par la formation du DISC (Hughes et al., 2009). Dernièrement, une étude montre que les deux événements, dimérisation et clivage inter- domaines p10 p20, sont nécessaires à l’activation de la caspase 8 (Oberst et al., 2010). D’autres événements moléculaires pourraient également influencer l’activation de la caspase 8. En effet, une étude récente a mis en évidence que la liaison de TRAIL sur ses récepteurs agonistes induit une ubiquitinylation de la caspase 8 qui favoriserait son aggrégation et son activation au sein du DISC (Jin et al., 2009).

Bien qu’aucun consensus n’existe réellement quant au mode précis d’activation de la caspase 8, son rôle fonctionnel primordial dans l’induction d’apoptose par les ligands de mort CD95L ou TRAIL a été mis en évidence dans plusieurs études (Juo et al., 1998 ; Salmena, 2003). Ainsi, la génération de souris déficientes en caspase 8 a permis de mettre en évidence l’importance de cette caspase dans la mort induite par les ligands de mort mais également son rôle primordial dans le développement embryonnaire en particulier du coeur, du tube neural et de progéniteurs hématopoiétiques (Varfolomeev et al., 1998). La génération de souris

exprimant une caspase 8 ne pouvant être clivée a permis de mettre en évidence que ce type de mutation, contrairement à ce qui est observé chez les souris caspase 8 KO, n’est pas létale (Kang et al., 2008). De plus, l’absence de clivage de la caspase 8 inhibe l’effet cytotoxique dépendant de CD95, in vitro et in vivo sans affecter les autres signalisations émanant de ce récepteur.

La caspase initiatrice 10, qui possède une homologie forte avec la caspase 8, est exprimée chez l’Homme mais pas chez la souris. Le rôle de la caspase 10, qui est également recrutée et activée au niveau du DISC, dans la signalisation apoptotique émanant des récepteurs CD95 ou TRAILRs, est controversé. Ainsi, les lymphocytes de patients atteints d’ALPS-CASP10 résistent à l’apoptose induite par TRAIL ou par CD95L (Wang et al., 1999). De plus, la surexpression de la caspase 10 dans des cellules Jurkat déficientes en caspase 8 permet de les resensibiliser vis-à-vis de CD95L (Wang et al., 2001). Un autre groupe indique que la caspase 10, recrutée au sein du DISC sous CD95L ou TRAIL induit l’apoptose de cellules n’exprimant naturellement pas la caspase 8 (Kischkel, 2001). Toutefois, le groupe d’Henning Walczak a montré que, bien que la caspase 10 soit recrutée au sein du DISC, elle ne pouvait pas compenser fonctionnellement la déficience en caspase 8 en réponse à TRAIL ou à CD95L (Sprick et al., 2002). Enfin, l’équipe de Thierry Levade a mis en évidence que le niveau d’expression de la caspase 10 endogène dans des cellules Jurkat déficientes en caspase 8, est corrélé avec leur niveau de sensibilité à CD95L (Milhas et al., 2005).

La caspase initiatrice 2 est également activée en réponse à CD95L ou à des anticorps agonistes anti-CD95. Toutefois, l’importance de cette caspase dans la mort induite par les ligands de mort reste peu connue et controversée. Une étude indique que la diminution d’expression de la forme longue de la caspase 2 diminue la sensibilité des cellules vis-à-vis de la mort induite par un anticorps anti-CD95 agoniste (Droin et al., 2001). Cette étude n’a toutefois pas permis de détecter la caspase 2 au sein du DISC. A l’inverse, le groupe de Peter Krammer a mis en évidence que cette caspase est recrutée et activée au sein du DISC du récepteur CD95, mais qu’elle ne peut se substituer à la caspase 8 pour l’induction d’apoptose (Lavrik et al., 2006).

Faisant suite à la formation du DISC, la formation d’un second complexe de signalisation, le complexe II, au cours de la signalisation de CD95 a été mis en évidence dans

différentes lignées lymphocytaires B et T. Ce complexe cytosolique, composé de la pro- caspase 8, des différentes formes de cFLIP et de FADD mais pas de CD95, permettrait d’amplifier l’activation des caspases (Lavrik et al., 2008). La formation de deux complexes consécutifs a également été proposée dans la signalisation du TNFR1. Le TNFR1 est en effet capable de recruter FADD et d’activer la cascade apoptotique, de façon indirecte, via l’intermédiaire d’une protéine adaptatrice nommée TRADD (pour TNFR-Associated via death domain) (Hsu et al., 1995). TRADD est aussi responsable du recrutement de la sérine/thréonine kinase RIP1 (pour Receptor (TNFRSF)-Interacting Protein) qui peut être à l’origine de voies des signalisations en faveur de la survie cellulaire ou de la mort (Hsu et al., 1996a ; Hsu et al., 1996b). L’équipe de Jurg Tschopp a observé la formation de deux complexes consécutifs, le complexe I comprenant le TNFR1 lui-même, TRADD, RIP1 et TRAF2 et le complexe II, formé après l’internalisation du TNFR1 et sa dissociation du complexe 1, regroupant TRADD, RIP1, FADD et la caspase 8 (Micheau & Tschopp, 2003). Ceci reste toutefois controversé, puisqu’un second modèle propose que le TNFR1 doit être internalisé pour former un DISC composé de TRADD, FADD et caspase 8, tandis que dans des cellules exprimant un TNFR1 ne pouvant être internalisé, un recrutement de RIP1 et TRAF2 par le TNFR1 est observé au niveau de la membrane plasmique (Schneider-Brachert et al., 2004). Ce complexe II existerait également dans la signalisation de TRAIL et serait composé de FADD, caspase-8, RIP1, TRAF2 et NEMO (IKK#) et permettrait l’activation de JNK et p38 et %F"& (Varfolomeev, 2005).

I.2.3.2.2. Les événements membranaires : l’initiation membranaire du signal et l’internalisation des récepteurs de mort.

En l’absence de stimulation, les récepteurs CD95, tout comme DR4 et DR5, sont pré- associés en trimères inactifs dont la formation dépend de la présence du domaine extracellulaire PLAD. Cette pré-association est nécessaire à l’induction du signal apoptotique par CD95L (Siegel, 2000).

Dans les toutes premières secondes suivant la liaison de CD95L sur son récepteur, donc avant l’activation de la caspase 8, les récepteurs CD95 seraient regroupés en aggrégats de 90 à 200 kDa résistants aux SDS et au mercaptoéthanol parfois nommés « CD95hi » dont la formation serait nécessaire à l’induction de la signalisation apoptotique sous-jacente (Algeciras-Schimnich & Peter, 2002 ; Kamitani et al., 1997 ; Papoff et al., 1999 ; Kischkel et al., 1995 ; Feig et al., 2006). Une équipe a proposé qu’il existerait en réalité plusieurs sous-

types de ces micro-aggrégats résistants au SDS, au moins trois, de 90 kDa, 200 kDa et 180 kDa (correspondants au « CD95hi ») en SDS-PAGE. FADD et la caspase-8 seront ensuite préférentiellement recrutées au sein de ces structures CD95hi pour former des hiDISC (pour high molecular weight DISC) (Feig et al., 2006). La formation de ces hiDISC serait dépendante de la palmitoylation du récepteur CD95.La formation physiologique des micro- aggrégats résistants au SDS, ainsi que leur rôle exact dans l’induction de la signalisation apoptotique sous-jacente ont été controversés. En effet, la formation de ces aggrégats semble être seulement la résultante de l’utilisation d’anticorps agonistes anti-CD95 et est absente lorsque les cellules testées sont traitées avec du CD95L sous sa forme soluble ou membranaire non étiquettés (Legembre et al., 2003). Une étude antérieure a également suggéré qu’il n’existe pas de corrélation entre la formation des micro-aggrégats de CD95 et la sensibilité à l’apoptose médiée par CD95 (Lee & Shacter, 2001).

Il a été mis en évidence que le récepteur CD95 pouvait se localiser au sein de microdomaines membranaires particulier appelés rafts, ou radeaux lipidiques, enrichis en sphingolipides et en cholestérol, dont le démantèlement inhiberait l’induction d’apoptose dépendante de CD95 (Hueber et al., 2002 ; Eramo et al., 2004 ; Muppidi & Siegel, 2004 ; Legembre et al., 2006). La localisation de CD95 au sein de ces microdomaines serait constitutive pour certains types cellulaires, dits de type I, tandis qu’elle serait induite par CD95L pour les cellules dites de type II, un processus apparemment indépendant de la formation du DISC et de la présence du DD de CD95 (cf. chapitre I.2.6) (Eramo et al., 2004 ; Muppidi & Siegel, 2004). Il a notamment été mis en évidence que certaines molécules de chimiothérapie pouvait favoriser la localisation et l’aggrégation des récepteurs CD95 au sein des rafts (Gajate et al., 2004 ; Gajate & Mollinedo, 2007). Les récepteurs CD95, en association avec CD95L sous sa forme membranaire, formeraient également des clusters supra moléculaires qui persisteraient plusieurs heures (Henkler et al., 2005). La formation de ces clusters est indépendante de la présence du domaine intracellulaire de CD95, de FADD, contrairement aux clusters formés en présence de CD95L soluble. De plus, les clusters formés par l’utilisation de CD95L membranaire sont également observés en présence de la méthyl-! cyclodextrine qui déplète les cellules en cholestérol, et déstabilise donc la structure des rafts, contrairement à ceux formés avec du CD95L soluble.

Une étude a également mis en évidence une étape suivante qui correspond à la formation de SPOTS (pour Signaling Protein Oligomeric Transduction Structures), des agrégats de récepteur CD95 à la surface cellulaire, colocalisés avec des composants des rafts, et dont la formation nécessite la présence de FADD et d’un DD intact sur CD95 mais ne dépend pas de l’activité caspase (Siegel et al., 2004).

L’étape suivante serait celle du capping ou du clustering, c’est-à-dire la formation de très larges regroupements (caps ou clusters) latéraux de récepteurs qui sont rapidement internalisés (Algeciras-Schimnich & Peter, 2002). La localisation de CD95 au sein des rafts ainsi que la formation des caps sont augmentées, par des élévations de céramide, un sphingolipide pro-apoptotique (cf. chapitre II.3.2.2) (Cremesti, 2001 ; Grassmé et al., 2003).

Figure 9. Chronologie potentielle des événements de signalisation émanant de CD95. L’interaction CD95-CD95L provoque dans un premier temps la formation de micro-aggrégats de CD95 résistants au SDS, les CD95hi qui vont transloquer au sein des radeaux lipidiques. Ce phénomène de translocation serait dépendant de la palmitoylation de CD95 et de l’association de CD95 au cytosquelette d’actine via l’ezrine. Une première vague de recrutement de FADD et de la caspase 8 en petite quantité aurait alors lieu. L’étape suivante est la formation de SPOTS ce qui conduit au capping ou clustering des récepteurs CD95. CD95 serait alors capable d’induire l’activation de la voie des MAPK et de NF"B, voies en faveur de la

prolifération cellulaire. L’étape suivante consiste en une internalisation clathrine et ezrine dépendante des récepteurs, phénomène en l’absence duquel l’apoptose ne peut être induite dans des cellules de type I. Au cours de l’internalisation, des quantités plus importantes de composants du DISC sont recrutés, permettant l’activation de la caspase 8 au sein de complexes de plusieurs mégadaltons (hiDISC), et l’induction de la signalisation apoptotique sous-jacente. CCP, clathrin-coated pit; CCV, clathrin-coated vesicle (Schütze et al., 2008)

La dernière étape correspondrait à l’internalisation des récepteurs CD95, étape majeure dans les cellules de type I (Eramo et al., 2004 ; Algeciras-Schimnich & Peter, 2003). Cette étape d’internalisation est induite indifféremment par du CD95L soluble ou membranaire, dépend de la polymérisation du cytosquelette d’actine et met en jeu un phénomène d’endocytose par des vésicules à clathrine (Lee et al., 2006). De plus, les différents composants du DISC seraient préférentiellement recrutés au sein des récepteurs CD95 du compartiment endosomal et l’inhibition du phénomène d’internalisation dans les cellules de type I diminue le recrutement des composants du DISC et l’induction de la signalisation apoptotique (Lee et al., 2006). L’inhibition de l’internalisation induite par CD95L induit une génération de signaux prolifératifs mettant en jeu Erk et NF"B (Lee et al., 2006). La palmitoylation du récepteur CD95 est nécessaire pour sa redistribution au sein des radeaux lipidiques et son association à l’ezrine et au cytosquelette d’actine, qui joue un rôle important dans son internalisation et l’induction du signal de mort sous-jacent (Chakrabandhu et al., 2006). Une région de CD95, située du coté intra-cytoplasmique, riche en lysine jouerait également un rôle important dans la localisation de CD95 dans les rafts et dans son internalisation (Rossin et al., 2010). Toutefois, l’importance de l’internalisation de CD95 dans les cellules de type I et l’implication du cytosquelette d’actine dans la signalisation apoptotique induite par le ligand naturel, sous forme soluble ou membranaire, a récemment été controversée (cf. chapitre I.2.6) (Chaigne-Delalande et al., 2009). Dans le cas du TNFR1, et quelque soit le modèle de formation des complexes signalisants considéré, l’internalisation est primordiale pour l’induction d’une signalisation pro-apoptotique. Toutefois, l’importance de l’internalisation des DR dans l’induction d’une signalisation apoptotique est également remise en cause par l’observation selon laquelle les récepteurs de TRAIL, bien qu’ils puissent subir ce phénomène, ne nécessitent pas d’être internalisés pour induire un signal apoptotique (Kohlhaas et al., 2007) .