Conclusion de l’article 1 :

Dans cette étude, nous avons utilisé dans un premier temps les cellules Jurkat I9-2e, doublement déficientes en caspases 8 et 10, très largement résistantes à l’apoptose induite par CD95L. Nous avons d’abord confirmé les données déjà publiées dans l’équipe qui mettent en évidence que l’induction d’apoptose par CD95L est corrélée au niveau d’expression de la caspase 10 par les différents clones d’I9-2. Les cellules I9-2e ont ensuite été transfectées de façon transitoire avec des plasmides codant pour les caspases 8 ou 10, catalytiquement actives, ou non, et incubées en présence, ou non, de CD95L et de zVAD-fmk. De façon intéressante, la réexpression de la caspase 8 seule, ou de la caspase 10 seule, permet de sensibiliser ces cellules à la mort induite par CD95L. A l’inverse, l’expression des caspases catalytiquement inactives ne permet pas de restaurer une sensibilité vis-à-vis de CD95L. Ces données confirment donc l’importance de la caspase 8 dans l’apoptose dépendante de CD95 et suggèrent à nouveau que la caspase 10, dans ce modèle, pourrait se substituer à la caspase 8 pour l’induction d’apoptose. De plus, cet effet sensibilisateur dépendrait de leur activité catalytique. Elles permettent également de confirmer que la résistance des cellules I9-2e n’est pas liée à un « effet clone », mais bel et bien à la double déficience en caspases 8 et 10. De façon intéressante, la seule surexpression de la caspase 8 ou 10 inactive, portant respectivement les mutations des cystéines catalytiques C360S et C401S, induit une légère augmentation de la mort cellulaire, ce qui suggère que ces protéases pourraient aussi avoir un effet cytotoxique indépendant de leur activité catalytique, même si cet effet semble relativement mineur dans ce contexte. Un autre groupe a déjà utilisé le même type de stratégie sur les cellules I9-2, la population parentale de cellules déficientes en caspase 8 dont est issu le clone I9-2e. Ainsi, le groupe d’Henning Walczak a généré plusieurs clones de cellules à partir des I9-2 réexprimant de façon stable, et à un niveau au moins comparable à des cellules Jurkat parentales A3, la caspase 10 (Sprick et al., 2002). Les auteurs indiquent qu’aucun des clones ne présente de sensibilisation vis-à-vis de l’apoptose induite par TRAIL. Certains de ces clones présentaient toutefois une sensibilité augmentée par rapport aux cellules I9-2 mais seulement aux plus fortes doses de CD95L testées, à partir de 100 ng/mL. Cet effet sensibilisateur aux fortes doses n’était pas nécessairement corrélé au niveau d’expression de la caspase 10. Il est alors envisageable que la caspase 10, qui est recrutée au niveau du DISC, puisse se substituer à la caspase 8 dans la signalisation de CD95 uniquement dans le cas d’un signal suffisamment fort ou prolongé, comme suggéré par d’autres auteurs (Kischkel, 2001). Il est également possible que certains des clones isolés dans l’étude de Sprick et de ses

collaborateurs présentent des modifications d’expression ou d’activité de molécules anti- apoptotiques, comme Bcl-2, ou des inhibiteurs de caspases, ou pro-apoptotiques tels que Bax, ce qui pourrait expliquer l’absence d’effet de la réexpression de la caspase 10. Il est à noter qu’une différence d’expression de CD95 peut d’ores et déjà être écartée, les auteurs ayant vérifié l’absence de variation d’expression de CD95 dans les différents clones (Sprick et al., 2002).

Nous avons ensuite cherché à évaluer l’impact de l’expression des caspases 8 ou 10 dans la mort cellulaire ayant lieu en présence de CD95L et de zVAD-fmk. Dans les cellules A3, la mort cellulaire induite par CD95L en présence de zVAD-fmk est caractérisée par une double positivité à l’Annexine-V et à l’iodure de propidium. De plus, les cellules présentent une condensation chromatinienne partielle sans diminution de la taille nucléaire, ce qui laisse penser à une mort ayant à la fois des caractéristiques de nécrose et d’apoptose. De façon intéressante, les cellules I9-2e sont complètement résistantes à ce type de mort cellulaire alors que le clone I9-2d, qui exprime naturellement la caspase 10, présente un pourcentage comparable de cellules Annexine V positives (et majoritairement IP positives), à celui des cellules parentales, ce qui suggère que l’expression de la caspase 10 est nécessaire à l’induction de ce type de mort. De plus, seule la réexpression transitoire de la caspase 10, mais pas de la caspase 8, dans les cellules I9-2e permettait de restaurer de façon significative la mort cellulaire en présence de CD95L et de zVAD-fmk, suggérant un rôle de la caspase 10 dans la mort dépendante de CD95 en présence de cet inhibiteur.

Afin de tester ces hypothèses dans un système cellulaire plus facilement transfectable et relativement sensible à la mort induite par CD95L, nous avons utilisé des cellules HeLa qui expriment naturellement la caspase 8 mais pas la caspase 10. La transfection transitoire de ces cellules pour induire la surexpression de la caspase 8 ou 10 induit une mort cellulaire dans les deux cas. En présence de zVAD-fmk, la toxicité induite par la surexpression de la caspase 8 est inhibée tandis qu’environ 15% des cellules transfectées surexprimant la caspase 10 sont Annexine V positives. En western blot, cet inhibiteur ne permet pas de bloquer totalement l’activation de la caspase 10 surexprimée, ni le clivage de PARP en présence de CD95L. Nous avons ensuite généré des cellules HeLa transfectées de façon stable pour surexprimer la caspase 10 et nous avons isolé deux populations surexprimant ou non la caspase 10 parmi les cellules résistantes à l’agent de sélection. Les cellules Casp 10 +, qui expriment un niveau faible de caspase 10 en comparaison à des cellules Jurkat A3, sont sensibles à la mort

cellulaire induite par l’association CD95L et zVAD-fmk, contrairement à des cellules contrôles. De plus, le clivage de la caspase 10, en réponse à CD95L, n’est pas inhibé par le zVAD-fmk. Ceci renforce donc l’hypothèse selon laquelle la caspase 10 participe à la mort cellulaire induite par CD95L en présence de zVAD-fmk. Ce type de mort est donc classiquement considéré à tort comme indépendant des caspases et le mécanisme d’intervention de la caspase 10 dans l’induction de cette mort reste à clarifier.

Ainsi, les résultats de cet article suggèrent que la caspase 10 pourrait participer à la fois à l’apoptose induite par CD95L et à la mort induite par CD95L ayant lieu en présence de zVAD-fmk. Ils remettent également en cause l’existence de la voie de mort caspase- indépendante induite par ce ligand.

II. Article 2 : L’inhibition caspase-dépendante de la synthèse de