Conclusion de l’article 2 :

Dans cette étude, nous avons mis en évidence que la SMS1, seule isoforme exprimée dans les cellules Jurkat, est inhibée dès 15 minutes après le début de la stimulation par CD95L, en fonction du temps et de la dose. Le début de cette inhibition est antérieur à l’élévation de céramide et à la diminution du taux de SM, elles-mêmes concomitantes à l’apparition de noyaux à morphologie apoptotique. Ceci indique que cette inhibition n’est pas une simple résultante de la mort cellulaire. De plus, l’inhibition de l’activité de synthèse de SM est un événement relativement proximal dans la signalisation de CD95, étant donné qu’elle a lieu en aval de l’activation de la caspase 8 mais en amont de celle de la caspase 9. La SMS1, qui est une enzyme Golgienne, subit une relocalisation dans le cytoplasme dans des cellules présentant une condensation chromatinienne tandis qu’elle n’est plus détectée dans des cellules à noyaux fragmentés. Ces différents phénomènes sont également observés pour la protéine Golgienne GM130, avec laquelle la SMS1 est colocalisée. Par ailleurs, la SMS1 est clivée au cours de l’apoptose et les caspases 2, 8, 9 et 7, mais pas les caspases 3 et 10, pourraient être responsables de ce clivage. Ces différentes données indiquent ainsi que la SMS1 est une enzyme qui est soumise au démantèlement de l’organite dans lequel elle réside au cours de l’apoptose, ce qui pourrait participer à une diminution de l’accessibilité de ses substrats, et donc à une inhibition de l’activité de synthèse de SM par défaut de substrat. Des données supplémentaires indiquent également que la synthèse de phosphatidylcholine, substrat des SMS, est également inhibée en présence de CD95L, ce qui constitue un second mécanisme d’inhibition de l’activité SMS. Par ailleurs, cette enzyme est clivée de façon caspase-dépendante au cours de l’apoptose, ce qui pourrait potentiellement avoir un effet inhibiteur sur son activité enzymatique spécifique. Ces différents phénomènes, sans en être nécessairement les seuls responsables, pourraient donc contribuer à l’inhibition de l’activité de synthèse de la SM dépendante de CD95.

La modulation de l’expression de la SMS1 dans deux modèles de cellules cancéreuses nous a permis de mettre en évidence son rôle fonctionnel dans la signalisation de CD95. Ainsi, la diminution de l’expression de la SMS1 dans des cellules Jurkat favorise l’accumulation de céramide, l’activation des caspases, en particulier des caspases 9 et 3 et l’apoptose dépendante de CD95. A l’inverse, la surexpression de la SMS1 dans des cellules HeLa inhibe l’élévation de céramide, l’activation des caspases, en particulier des caspases 9 et 3, et l’apoptose dépendantes de CD95. Par ailleurs, la diminution de l’expression de la SMS1

endogène sensibilise également des cellules parentales HeLa à l’apoptose induite par CD95L. Ces observations suggèrent donc que moduler l’expression de la SMS1 est un moyen de réguler l’apoptose induite par CD95L dans deux types de cellules cancéreuses. Des données supplémentaires indiquent que la surexpression de la SMS2 n’induit pas de résistance significative à l’apoptose induite par CD95L dans des cellules HeLa. Toutefois, la diminution de l’expression de la SMS2 dans des cellules qui la surexpriment permet de les sensibiliser. La différence d’effet des SMS1 et 2 sur la signalisation de CD95 pourrait s’expliquer par leur différence de localisation cellulaire. Ainsi la SMS2 régule le pool de SM situé au niveau de la membrane plasmique tandis que la SMS1 est responsable de la synthèse de la SM Golgienne. Des variations des taux des différents lipides, substrats ou produits de la réaction, dans un compartiment subcellulaire particulier pourraient donc avoir un rôle particulièrement important dans la modulation de la réponse à CD95L. Par ailleurs, selon les expériences d’interférence à l’ARN réalisées dans cette étude et d’après les données de la littérature, la SMS1 est responsable de 60% de l’activité de synthèse de SM contre 40% pour la SMS2 dans les cellules HeLa, ce qui pourrait expliquer également l’effet plus modéré de la modulation de l’expression de cette dernière enzyme. Enfin, la SMS2, contrairement à la SMS1, possède également une seconde activité enzymatique de synthèse de céramide phosphoéthanolamine qui pourrait, elle aussi, avoir une influence différente vis-à-vis de la signalisation de CD95.

Concernant les mécanismes possibles de la modulation de la signalisation de CD95 par la SMS1, nous avons observé dans cette étude que l’activation des caspases 9 et 3 étaient particulièrement modifiées en réponse à CD95L suite à la modulation de l’expression de la SMS1, suggérant que l’intensité de l’activation de la voie mitochondriale soit plus particulièrement modulée par cette activité enzymatique. Par ailleurs, l’équipe du Dr Patrick Legembre, avec lequel nous collaborons, a mis en évidence que les cellules HeLa surexprimant la SMS1 présentaient une formation du DISC de CD95 diminuée en comparaison à des cellules contrôles (Figure 24). Ceci suggère que l’effet inhibiteur de l’expression de cette enzyme sur cette signalisation pourrait en partie être du à une modulation d’un ou plusieurs événements précoces.

Nos résultats indiquent que la sphingomyéline synthase 1 est un substrat des caspases fonctionnellement impliqué dans l’apoptose dépendante de CD95 dans les cellules Jurkat et HeLa. Comme évoqué dans la revue générale, il existerait deux grands groupes de types cellulaires, les cellules de type I et les cellules de type II (dont les cellules Jurkat et HeLa), qui différent par plusieurs aspects dans la signalisation de CD95. Etant donné que la régulation du taux de céramide et des sphingolipides plus complexes, dont la SM, par plusieurs enzymes du métabolisme sphingolipidique influence la signalisation de CD95, nous avons réalisé des expériences préliminaires afin de déterminer si les cellules de type I ou II peuvent également être distingués selon leur métabolisme sphingolipidique. Des premiers résultats d’évaluation globale du métabolisme sphingolipidique par marquage métabolique à la sphingosine tritiée indiquent que les cellules de type I H9 et SKW6.4 convertissent moins de sphingosine tritiée en divers sphingolipides que les cellules de type II Jurkat et CEM (Figure 25). Aucune distinction ne pouvait, à l’inverse, être réalisée en fonction des taux de SM, GlcCer, LacCer ou céramide entre les deux groupes de cellules. Par ailleurs, le taux de deux espèces de sphingolipides, des gangliosides ne pouvant être clairement identifiés par ce protocole expérimental, semble varier de façon opposée dans les cellules de type I et de type II (Figure 26).

Figure 24 : Les HeLa SMS1 présentent une diminution de la formation du DISC de CD95. 20.106 cellules ont été stimulées à 4°C (0 min) ou à 37°C (15 min) avec 1 µg/ml d’anticorps agoniste anti-CD95 monoclonal anti-APO 1-3 puis lysées. CD95 a été immunoprécicpité avec des billes recouvertes de protéine A et le complexe moléculaire associé à été analysé par électrophorèse (10% SDS-PAGE). Les anticorps utlisés sont indiqués. 20 µl de lysat total ont été déposés comme contrôle de quantité de protéine (Données de l’équipe du Dr Patrick Legembre).

Il serait intéressant d’une part d’identifier les gangliosides qui varient entre ces deux groupes de cellules, et d’autre part de réaliser une analyse plus exhaustive des glycosphingolipides ainsi que de poursuivre ces expériences dans d’autres cellules de type I et II, afin de déterminer si il s’agit de différences retrouvées de façon systématique entre les deux types cellulaires. Nous avons également évalué l’activité de synthèse de SM et de GlcCer in vitro dans les différents types cellulaires. Alors que l’activité GCS ne semble pas être différente entre les cellules de type I et de type II, l’activité de synthèse de SM est augmentée de façon significative dans les cellules de type I comparées aux cellules de type II (Figure 27). Bien

Figure 25 : La conversion de la sphingosine en sphingolipides est inférieure dans les cellules de type I par rapport aux cellules de type II. 500 000 cellules Jurkat, H9, SW6.4 et CEM sont incubées en présence de [3H]-sphingosine (0,25 !Ci/ml) (PerkinElmer), un précurseur de la synthèse des

sphingolipides, pendant 48 heures pour marquer les sphingolipides à l’équilibre. Des culots cellulaires sont ensuite réalisés. Les lipides sont extraits à partir des culots cellulaires. Les résidus lipidiques sont repris par

20 !l de chloroforme/méthanol (2 :1, v/v) puis séparés par chromatographie sur couche mince dans un

système de migration contenant chloroforme/méthanol/eau (100:42:6, v/v/v). La distribution des sphingolipides radiomarqués sur la plaque de chromatographie est analysée grâce à un radiochromatoscanner (Bertold). Les différents sphingolipides sont ensuite quantifiés par scintillation. Les données sont des moyennes +/- E.S.M de 2 à 3 expériences indépendantes sur chacune des lignées (2 de type I et 2 de type II).

Figure 26 : Les cellules de type I et II présentent des différences de synthèse de certains glycosphingolipides. Les données sont des moyennes +/- E.S.M de 2 à 3 expériences indépendantes sur chacune des lignées.

que ceci ne semble pas avoir d’impact sur la production de SM en basal, puisqu’aucune différence de contenu en SM radiomarquée évaluée par marquage à la sphingosine tritiée n’a pu être détectée (données non montrées), il est envisageable que ceci soit important dans le cas de stress cellulaires au cours desquels les taux de substrats peuvent varier. Il pourrait donc être intéressant d’évaluer également le métabolisme des sphingolipides de façon plus exhaustive et précise par spectrométrie de masse, dans ces différents types de cellules et en condition de stress cellulaire, notamment sous CD95L ou d’autres ligands de DR.

Figure 27 : Les cellules de type I ont une activité spécifique de synthèse de SM plus élevée que les cellules de type II. Les données sont des moyennes +/- E.S.M de 6 expériences indépendantes (3 pour chaque lignée).

III. La sphingomyéline synthase 1 inhibe l’apoptose induite par