I. 2.3.1.4.2 Expression et rôles physiologiques de TRAIL et de ses récepteurs.
I.2.5. Activation des caspases effectrices et « éxecution » de l’apoptose 1 Mode d’activation des caspases effectrices.
Les pro-caspases effectrices sont constitutivement associées en dimères et le restent une fois activées. Chaque monomère composant ce dimère inactif est constitué d’une petite sous unité (p10) et d’une grande sous unité (p20) non dissociées, liées par un domaine intermédiaire. En réponse à un stimulus apoptotique, les caspases initiatrices actives clivent les caspases effectrices après des résidus aspartates, permettant ainsi leur activation. Les domaines p10 et p20 sont d’abord séparés par un ou deux clivages, puis le pro-domaine est séparé de la grande sous-unité (Ramage et al., 1995 ; Yamin et al., 1996). Le clivage entre les
Figure 13. Le PIDDosome. Le PIDDosome comprend la protéine PIDD, dont le DD interagît avec le DD de la protéine RAIDD. Le domaine CARD de la protéine RAIDD interagît avec celui de la caspase 2 (Bao & Shi, 2006).
deux sous-unités p10 et p20 induit un changement conformationnel qui permet l’alignement des différents sites de liaison du substrat et la localisation adéquate des résidus catalytiques permettant d’augmenter de façon drastique l’activité catalytique des caspases effectrices (Chai et al., 2001 ; Riedl et al., 2001). Le clivage d’un seul des deux domaines inter-sous unités du dimère permet ainsi une activation efficace et irréversible de la caspase 7 (Denault et al., 2006) (Figure 14). Les caspases effectrices activées sont donc des dimères comportant deux sous unités p10 et deux sous unités p20.
I.2.5.2. Substrats des caspases et rôle dans le démantèlement cellulaire.
Bien que toutes les caspases clivent leurs substrats en C-terminal d’un aspartate, elles possèdent des spécificités différentes. Ces différences dépendraient, au moins in vitro, de l’acide aminé présent en position P4 (Thornberry et al., 1997). Il a ainsi été mis en évidence que les caspases 3, 7 et 2 cliveraient préférentiellement des substrats présentant un aspartate en position P4 alors que les caspases 6, 8, 9 et 10 seraient plus enclines à cliver des substrats comportant une leucine ou une valine en position P4 (Thornberry et al., 1997). Les spécificités in situ sont probablement plus complexes, et dépendraient également des résidus P5 à P2, du résidu P1’ et des structures tertiaires et quaternaires des substrats (Crawford & Wells, 2011). Alors que les caspases initiatrices semblent cliver peu de substrats, clivant préférentiellement les caspases effectrices, plusieurs centaines de substrats des caspases effectrices, presque 5% du protéome, sont actuellement connus (Crawford & Wells, 2011). Le clivage de certains substrats semble jouer un rôle primordial dans le processus apoptotique
Figure 14. Modèle d’activation de la caspase effectrice 7. La procaspase-7 est pré-associée en dimère, mais inactive, en l’absence de tout stimuli apoptotique. Le clivage entre chaque petite (en vert) et grande (en bleu) sous-unité permet un changement conformationnel menant à la libération des sites actifs (boucles L2) disponibles pour la liaison d’un substrat ou d’un inhibiteur (représenté en rouge) (Chai et al. 2001).
alors que d’autres substrats seraient de simples « by-standers » de la protéolyse dont le clivage n’influencerait pas le processus de mort cellulaire. Le clivage par les différentes caspases se fait généralement en nombre limité, à un ou quelques sites précis. Cela peut résulter en une inactivation de la protéine cible, mais aussi en son activation, via par exemple le clivage d’une sous unité inhibitrice (Figure 15).
Les caspases peuvent d’une part cliver et inactiver des protéines qui protègent la cellule de l’apoptose. C’est notamment le cas du clivage d’ICAD (pour Inhibitor of Caspase Activated Deoxyribonuclease), un inhibiteur de CAD qui est une nucléase participant à la fragmentation inter-nucléosomale de l’ADN au cours de l’apoptose. Le clivage d’ICAD par les caspases permet ainsi la libération de CAD active (Liu et al., 1997 ; Enari et al., 1998). Plusieurs facteurs intervenant dans la transcription et dans la traduction sont également substrats des caspases et leur clivage s’accompagne de leur perte de fonction. De plus, suite à la perméabilisation de la membrane externe de la mitochondrie, les composants de la chaine respiratoire deviennent accessibles aux caspases effectrices qui, en clivant certaines de ces protéines, conduisent à une perte rapide de la fonction métabolique de cet organite (Ricci et al., 2004). À l’inverse, certains clivages induisent un gain de fonction de la protéine. Ainsi, dans le cas de Bid, le clivage permet de générer un fragment activateur de l’apoptose (Luo et al., 1998) (cf. chapitre I.2.4). Il est également à noter que les caspases effectrices elles-mêmes sont capables de cliver les caspases initiatrices (Sohn, 2004).
Figure 15. Modes d’action des caspases dans le démantèlement cellulaire. Les caspases participent au démantèlement cellulaire en : A : Inactivant des inhibiteurs de protéines en faveur de l’apoptose (ICAD par exemple) ; B : désassemblant des structures cellulaires (protéines du ou associées au cytosquelette, protéines de structure des organistes par exemple) ; C : dérégulant l’activité de protéines en séparant des
domaines régulateurs de domaines
catalytiques, ce qui peut résulter en une perte ou un gain de fonction (gelsoline par exemple) (Thornberry 1998).
De nombreux substrats des caspases sont des protéines de structure cellulaire dont la fonction est altérée suite à leur clivage. Ainsi, les différents réseaux formant le cytosquelette cellulaire sont démantelés suite au clivage de plusieurs des protéines qui le composent ou régulent leur structure. Un certain degré de démantèlement du cytosquelette serait ainsi nécessaire au phénomène de bourgeonnement de la membrane plasmique. L’actine et des protéines qui lui sont associées comme la gelsoline (Kothakota, 1997), entre autres, sont toutes substrats des caspases. Le clivage de la gelsoline permet de générer un fragment qui est constitutivement actif (Kothakota, 1997). De plus, ROCK1, une kinase qui peut phosphoryler la chaine légère de la myosine et modifier la dynamique du cytosquelette d’actine, est également clivée par les caspases en C-terminal et le fragment N-terminal ainsi généré est constitutivement actif. Ceci induit une phosphorylation de la chaine légère de la myosine et la contraction de faisceaux d’actine, ce qui pourrait jouer un rôle dans les phénomènes de bourgeonnement (Coleman et al., 2001 ; Sebbagh et al., 2001). Les microtubules sont également affectés par cette protéolyse caspase-dépendante étant donné que plusieurs protéines associées aux microtubules, telle que la dynéine (Lane et al., 2001), sont substrats des caspases. Enfin, certaines protéines qui composent les filaments intermédiaires, telles que la vimentine, les kératines et les lamines nucléaires, sont également cibles des caspases (Morishima, 1999 ; Ku et al., 1997). Concernant les lamines nucléaires, leur protéolyse par les caspases participerait aux phénomènes de condensation et de fragmentation nucléaire (Rao et al., 1996). Ainsi, l’expression de formes de lamines résistantes au clivage par les caspases permet de prévenir la perte de l’intégrité nucléaire et de retarder la fragmentation de l’ADN (Rao et al., 1996). La fragilisation de la lamina nucléaire associée aux modifications du cytosquelette cytoplasmique permettrait les phénomènes de fragmentation. Enfin, des clivages médiés par les caspases de protéines constitutives des points focaux d’adhésion, des jonctions inter-cellulaires et des desmosomes participeraient au phénomène de détachement de la matrice extracellulaire et à la perte de contact entre cellules avoisinantes.
Le clivage de certaines protéines participerait au phénomène de fragmentation des organites. C’est notamment le cas pour p115, dont le produit de clivage C-terminal par les caspases 3 et 8 participerait au phénomène de fragmentation golgienne (Chiu et al., 2002). Plusieurs autres protéines golgiennes, comme GRASP65 ou la giantine, sont également substrats des caspases et leur clivage serait impliqué dans ce phénomène de fragmentation. La mitochondrie subit également un phénomène de fragmentation, mais les caspases n’ont pas
été majoritairement impliquées dans ce phénomène, qui pourrait dépendre des membres Bax et Bak de la famille de Bcl-2 (Karbowski et al., 2006).
I.2.5.3. Autres protéases impliquées dans l’apoptose.
Plusieurs protéases autres que les caspases, dont des sérine protéases, les calpaïnes, les cathepsines ainsi que le protéasome, peuvent être impliquées dans le déclenchement de l’apoptose.
Parmi les sérine protéases pouvant être impliquées dans l’apoptose, les granzymes sont une famille de protéases, contenues dans les granules lytiques de lymphocytes T et des cellules NK et qui peuvent être exocytées pour lyser des cellules à éliminer en association avec la perforine. Granzyme A et B sont les plus abondantes au sein de ces granules lytiques. De façon similaire aux caspases, Granzyme B clive ses substrats après un résidu acide aspartique et peut ainsi cliver et activer plusieurs caspases, telle que la caspase 3, ainsi que la protéine Bid (Martin et al., 1996 ; Barry et al., 2000), induisant ainsi une mort cellulaire par apoptose. Des lymphocytes T cytotoxiques déficients en granzyme B ont ainsi une capacité réduite d’induction de la fragmentation de l’ADN et de l’apoptose de cellules cibles (Heusel
et al., 1994).
Les calpaïnes sont une famille de cystéine protéases neutres cytoplasmiques, dont certaines sont ubiquitaires, comme les calpaïnes m et µ, et d’autres tissus-spécifiques. Leur activité est dépendante du taux calcique intracellulaire et elles sont donc activées en réponse à des signaux apoptotiques favorisant des élévations de calcium intracellulaire, notamment ceux induisant un stress du réticulum endoplasmique. De nombreux substrats des calpaïnes sont des protéines des réseaux constituant le cytosquelette et elles pourraient donc jouer un rôle important dans les modifications morphologiques caractéristiques de l’apoptose. Les pro- caspases 7, 9, 10 et 12 sont également substrats des calpaïnes mais, alors que ce clivage est activateur pour les caspases 10 et 7, il semble inhibiteur pour la caspase 9 (Storr et al., 2011). Certains membres de la famille de Bcl-2 peuvent également être clivés par cette famille de protéases, ce qui pourrait moduler leur fonction. Par exemple, le fragment N-terminal de Bax formé après clivage par les calpaïnes, serait actif pour induire le relargage du cytochrome c (Gao & Dou, 2000).
Les cathepsines sont une famille de protéases lysosomales subdivisées en trois groupes, les cathepsines A et G sont des sérine protéases, les cathepsines D et E des acide aspartique protéases et les autres membres sont des cystéine protéases. Elles sont activées par clivage essentiellement au sein du lysosome et sont libérées depuis le lysosome vers le cytosol après perméabilisation du lysosome, phénomène pouvant être induit au cours de l’apoptose. Certaines cathepsines sont capables de cliver Bid en t-Bid qui jouera sa fonction pro-apoptotique classique d’activateur de la voie mitochondriale (Droga-Mazovec et al., 2008). Les cathepsines pourraient également cliver et activer les caspases effectrices 3 et 7.
Le protéasome est également impliqué dans la régulation de l’apoptose. Ainsi, le protéasome participe à la dégradation de molécules anti-apoptotiques dans des cellules apoptotique. Les IAP (pour Inhibitor of Apoptosis Protein) (cf. chapitre I.2.7.1.3), sont des protéines anti-apoptotiques. Il a été mis en évidence que les IAP, qui possèdent un domaine leur conférant une activité E3 ubiquitine ligase, s’auto-ubiquitinylent ce qui entraine leur dégradation protéasome-dépendante (Yang, 2000).