de leur expression au cours du développement
II. Mesure de l'expression des gènes candidats au cours du développement
2. Sexage des juvéniles A. nasatum
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II. Mesure de l'expression des gènes candidats au cours du
développement
1. Echantillonnage de juvéniles pour étudier l'expression des gènes candidats au cours du développement
Pour A. nasatum, les individus analysés étaient les descendants des individus utilisés pour le séquençage PacBio (dont la population originelle provient de Thuré, 79, France). Dans le cas d'A. vulgare, les individus prélevés étaient issus de croisements entre deux lignées asymbiotiques du laboratoire : la lignée BF en provenance de Nice (06, France) et la lignée ZM en provenance d'Héraklion (Grèce). Pour les deux espèces, les juvéniles ont été collectés individuellement deux à quatre jours après chaque mue, et ce de la première mue correspondant à des individus indifférenciés (individus de stade 1) à la sixième mue correspondant à des individus totalement différenciés (stade 6), puis congelés dans de l'azote liquide. Des individus adultes ont aussi été analysés, issus des mêmes lignées que les juvéniles.
2. Sexage des juvéniles A. nasatum
Les isopodes terrestres étant sexuellement indifférenciés au cours de leurs premiers stades de développement post-naissance (Katakura, 1984; Suzuki & Yamasaki, 1995; Badawi et al., 2015), il est nécessaire de procéder à un sexage moléculaire des individus si l'on veut étudier l'expression sexe-spécifique des gènes identifiés in silico au cours du développement. Afin d'obtenir des pools d'ARN de mâles et de femelles séparément, il était nécessaire d'extraire indépendamment l'ADN de chaque individu (pour le sexage) et dans un second temps l'ARN de pools d'individus sexés (pour étudier l'expression des gènes). Dans le but de limiter la perte de matériel biologique par individu (c'est-à-dire dans l'objectif de maximiser le rendement de l'extraction ARN), un protocole d'extraction d'ADN particulier a été mis au point, adapté de la méthode décrite par Carvalho et al. (2009). Une à deux pattes de chaque individu ont été prélevées et placées directement dans 10 µL de protéinase K (20 mg.mL-1). Les pattes ont
ensuite été incubées durant 1 h à 56°C, puis 2 minutes à 95°C afin d'inactiver la protéinase K. Le sexage moléculaire n'a pu être réalisé que pour l'espèce A. nasatum, les marqueurs du chromosome W d'A. vulgare n'étant pas encore disponibles au moment de ces expériences. La qualité des ADN extraits a été vérifiée à l'aide d'amorces génomiques ciblant le gène ARNr 18S (la liste des amorces générales est disponible dans l'Annexe VII). Les individus d'A. nasatum ont été sexés en utilisant trois marqueurs Y-spécifiques validés (scf7180001685477, scf7180001550276 et scf7180001797263).
3. Quantification de l'expression des gènes candidats au cours du développement des mâles et femelles A. nasatum et A. vulgare
Afin d’obtenir suffisamment de matériel pour les analyses d’expression en RT-qPCR, les extractions d’ARN ont été réalisées sur des pools d’individus sexés. Pour chacun des deux sexes, dix juvéniles de stade 2 ont été poolés, neuf pour le stade 3, six pour le stade 4, quatre pour le stade 5 et trois pour le stade 6 et les adultes. Ces pools ont été effectués en trois réplicas par sexe et par stade de développement. L'ARN des échantillons a été extrait à partir du kit d'extraction ARN TRIzol (ThermoFisher Scientific) en suivant le protocole fourni. La concentration d'ARN a été mesurée avec un Qubit 2.0 (Invitrogen). Afin de s'assurer de l'homogénéité de dégradation des différents ARN extraits, leur qualité a été évaluée avec un système de migration par électrophorèse MultiNA (Shimadzu).
L'ARN des échantillons extraits a reçu un traitement DNase (RNase-Free DNase Set, Qiagen) avant de réaliser une transcription inverse (kit SuperScript II Reverse Transcriptase, ThermoFisher), à partir de 250 ng d'ARN issus de chaque échantillon (Annexe II pour la description détaillée du protocole). L'expression des gènes candidats a tout d'abord été testée par PCR non quantitative sur les ADN complémentaires (ADNc) obtenus après l'étape de transcription inverse, suivie d'une migration sur gel d'agarose afin de s'assurer de la spécificité des amplifications (Annexe II pour la description détaillée du protocole).
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Des amorces de PCR quantitative ont été dessinées pour les gènes d'intérêt identifiés in silico. Elles ont été réalisées de sorte qu'elles puissent amplifier l'ADN complémentaire à la fois d'A. vulgare et celui d'A. nasatum. Ces amorces ont été dessinées à l'aide du logiciel Primer3Plus (version 2.4.0, Untergasser et al., 2012) réglé sur l'option qPCR. La liste des amorces utilisées est indiquée dans le Tableau 23. De plus, la présence de deux copies d'un homologue du gène Dsx, identifiées chez A. nasatum, a aussi été vérifiée par PCR (Tableau 23), et ce au sein des deux sexes. La spécificité des amorces a été vérifiée par BLASTn en alignant les amorces dessinées contre les génomes d'A. nasatum et d'A. vulgare. Tableau 23 : Liste des amorces utilisées pour l'analyse de l'expression de gènes candidats impliqués dans le déterminisme du sexe chez A. vulgare et A. nasatum. Les amorces pour les gènes de référence Elongation factor 2 et Rbl8 sont issues de Chevalier et al. (2012).
Locus Séquences des amorces
Taille du produit de PCR (nucléotides) Température de fusion Forward Reverse gènes candidats
DSX-like CCCCAGGGTGAAATGTTTGATG TCCAGAACTTGTAGAGGCTTCG 126 60°C
DMRT99B-like TCAAAGGACACCCAAATGCG AGCGTTTATGTCCCTTCAGC 71 60°C
DMRT93B-like ACAGTAGCTTACCCGACAACG CATTCCGTGATTTCGACACCTC 72 60°C
Transformer2-A-like GCTCTGGGATGGAAATTGACG TTGGAGTGTGTGGTCTTTCG 72 60°C
Transformer2-B-like TCACCAAAACGAAGCAGGAG TCCGTTGTGTAGAGACTGAGAC 143 60°C
gènes de référence
Elongation Factor 2 GTCAGATCATTCCCACAACA TTTCCTCAAATACCACTCCAC 164 60°C
Rbl8 AACTGGAGATAGAGGCAAA CCACCAGCAGCAATTC 159 60°C
Test de la présence de deux copies de DSX chez A. nasatum
5150/21795-DSX CCTTATCGTGATTGCAACTG CACGTCGTAAAGGAGACTTG 414 52°C
L'expression des gènes candidats potentiellement impliqués dans le déterminisme du sexe a ensuite été quantifiée selon le sexe au cours du développement par PCR quantitative (LightCycler 480, Roche ; Annexe II pour la description détaillée du protocole). Pour chaque condition (sexe, stade de développement), les mesures ont été réalisées en triplicatas biologiques, eux-mêmes réalisés en duplicatas techniques (donc 6 mesures effectuées par condition). Les mesures ont été réalisées pour les stades 2, 3, 4, 5, 6 et adultes pour A. nasatum. En revanche, puisqu'il n'a pas été possible de sexer à l'aide de marqueurs moléculaires les juvéniles A. vulgare, les mesures ont été effectuées
seulement pour les stades 6 et adultes chez cette espèce (seuls stades pouvant être sexés phénotypiquement avec certitude).
L'expression relative des gènes se calcule en fonction de l'expression de gènes de référence, dont l'expression est stable d'une condition à l'autre (ici une expression stable entre les sexes, et au cours du développement). Les deux gènes de référence utilisés sont issus de précédents travaux réalisés au laboratoire sur A. vulgare, à savoir les gènes Rbl8 et Elongation Factor 2 (Chevalier et al., 2012). Afin de confirmer ces gènes de référence chez A. nasatum et selon nos conditions d'étude, la stabilité d'expression de ces gènes, le logiciel geNorm a été utilisé (Vandesompele et al., 2002). Les auteurs de cette étude préconisent que le facteur de stabilité (appelé M) des gènes de référence doit être 0.7, sachant que plus ce facteur est élevé, moins les gènes étudiés sont exprimés de façon stable entre les différentes conditions. Dans notre cas, l'utilisation des gènes Rbl8 et Elongation factor 2 présente une valeur M = 0.440. L'expression des deux gènes de référence utilisés en fonction des stades de développement est représentée en Figure 45.
Figure 45 : Expression des gènes de référence Rbl8 et Elongation Factor 2 en fonction des stades de développement. Les histogrammes correspondent à la valeur moyenne des Ct mesurés pour chaque stade de développement et les barres verticales au sommet des histogrammes représentent l'écart-type.
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Le calcul de l'expression relative des gènes candidats a été réalisé en suivant la méthode du 2-Ct (Livak & Schmittgen, 2001), c'est à dire que l'expression d'un gène normalisée (par les gènes de référence) est indiquée en fonction de l'expression de ce même gène normalisé à un stade donné, et ce indépendamment pour chaque sexe. Dans le cas d'A. nasatum, l'expression a été normalisée par rapport au stade 2 (car il correspond à un stade où la différenciation sexuelle n'a pas encore débuté) tandis que pour A. vulgare, ce ratio a été calculé par rapport au stade adulte. Le calcul se décompose de la façon suivante :
!!" !"#$%&'( !"#$%&') avec :
!"#$%&'( *"+,-'./0'1#$%&'( *"+,-'232'-.'1#$%&'( !"#$%&') *"+,-'./0'1#$%&') *"+,-'232'-.'1#$%&')
" * "44 * 5"6 " 78"
Afin d'obtenir une valeur correspondant au ratio d'expression d'un gène donné par rapport au stade 2, la formule donne enfin :
8" 9:!!;$
Afin de pouvoir comparer l'expression des gènes cibles entre A. nasatum et A. vulgare, les résultats obtenus pour A. nasatum ont aussi été calibrés par rapport au stade adulte.