B- Physiopathologie de l’infection par les Coronavirus
IV- Séquençage à haut débit
Les cellules MRC-5 ont été ensemencées en boîte de Pétri 60 X 15 mm à hauteur de 2.106
cellules/puits en triplicata. Ces cellules ont été inhibées pour l’expression de KSRP par transfection d’un siARN KSRP (5 µM) ou traitées avec un siARN contrôle (5 µM). Les cellules ont été infectées 24 heures post-transfection des siARNs par la souche HCoV-229E à une M.O.I de 1 pendant 24h. Les cellules ont été lavées au PBS -/-, « crosslinkées » aux UV à 400 mJ/cm2 et 200 mJ/cm2 puis lysées dans un tampon de lyse « RLT » (Qiagen). Un deuxième panel de cellules a été utilisé comme contrôle non-infecté ou a été infecté pendant 24h avec la souche HCoV-229E à une M.O.I de 1, puis les cellules de chaque condition ont été lysées selon le même protocole que précédemment. Les ARN ont été extraits avec le kit « RNeasy mini kit » (Qiagen) et quantifié avec le nanodrop 1000 (Life Technologie)
A partir d’une concentration de 50 ng/µl, l’ARN total a été séquencé avec le kit « TruSeq stranded Total RNA, Ribozero human, mouse, rat, Illumina) (Figure 30). Une étape de dénaturation des échantillons a été réalisée à 68°C pendant 5 min puis la déplétion des ribosomes a été effectuée en incubant les échantillons avec des billes magnétiques pendant 1 min et en les incubant 1 min supplémentaire à température ambiante. Le surnageant a été collecté puis les ARN ont été purifiés en les incubant avec des billes magnétiques « RNA clean up XP beads » (Beckmann Coulter, Californie, Etats-Unis) 15 min à température ambiante, puis 5 min sur portoir magnétique. Deux lavages à l’éthanol 70% ont été
102 effectués, puis les billes contenant les ARN ont été récupérées. Les ARN ont été fragmentés en les incubant avec un tampon de fragmentation 8 min à 94°C. L’ADNc a été synthétisé en utilisant l’enzyme de transcription « Supercript II Reverse Transcriptase » (Life technologie) en suivant le programme suivant : 10 min à 25°C, 15 min à 42°C et 15 min à 70°C. Le second brin d’ADN a ensuite été synthétisé en utilisant le kit « Second strand marking master mix » puis incubé 1h à 16°C. L’ADN a ensuite été purifié avec de l’EtOH 80% sur bille comme précédemment. Une adénine a été ajoutée aux extrémités 3’ des fragments en incubant les échantillons avec un mix d’adénine 30 min à 37°C puis 5 min à 70°C. Les adaptateurs contenant les index ont été liés aux fragments par complémentarité entre l’adénine à l’extrémité 3’ et la thymine présente sur les adaptateurs. Les échantillons ont été incubés avec les adaptateurs et avec un mélange de ligation 10 min à 30°C puis ont subis une étape de purification sur billes. Les fragments d’ADN ont ensuite été amplifiés par PCR en suivant le programme suivant :
Suite à une dernière étape de purification sur bille, la librairie a été validée par électrophorèse en utilisant le kit « High sensitivity D1000 Screentape » (Agilent) sur l’appareil « Tapestation 4200 System » (Agilent). Les échantillons ont ensuite été quantifiés par fluorescence avec le kit « Picogreen DNAquantification » (Life Technologie) et ont été normalisés à 10nM. -30 sec à 98°C -10 sec à 98°C -30 sec à 60°C -30 sec à 72°C -5 min à 72°C 15 cycles
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Figure 30 : Etape principale du séquençage à haut débit réalisé sur de l’ARN total
Parallèlement, une banque de miARN a été réalisée à partir d’1µg d’ARN extrait en utilisant le « RNeasy mini kit » (Qiagen) en suivant le protocole du kit « Truseq Small RNA » (Illumina) (Figure 32). Une première étape de fixation des adaptateurs aux extrémités 3’ et 5’ des ARN a été réalisée. Les échantillons ont été incubés avec les adaptateurs 3’ 2 min à 70°C puis avec l’enzyme de ligation « T4 RNA ligase depletion mutant » 1h à 28°C. Les adaptateurs 5’ ont été incubés 2 min à 70°C puis ont été rajoutés au mélange contenant les échantillons et les adaptateurs 3’. L’ensemble a été incubé avec 10 mM d’ATP et avec la « T4 RNA ligase » pendant 1h à 28°C. Une étape de transcription inverse a ensuite été effectuée. Les amorces ont été incubées avec 12.5 nM de dNTP pendant 2 min à 70°C puis ont été mises en contact avec les échantillons et avec l’enzyme de transcription inverse « Superscript II reverse transcriptase » 1h à 50°C. Les ADNc ont ensuite été amplifiés par PCR en suivant le programme suivant : -30 sec à 98°C -10 sec à 98°C -30 sec à 60°C -15 sec à 72°C -10 min à 72°C 11 cycles
104 La librairie a été validée par électrophorèse en utilisant le kit « High sensitivity D1000 Screentape » (Agilent) sur l’appareil « Tapestation 4200 System » (Agilent).
Les ADNc ont été purifiés par excision après migration sur gel de polyacrylamide à 145 Volts pendant 60 min.
Les bandes d’intérêt ont été découpés entre les marqueurs de taille 145 pb et 160 pb afin de récupérer spécifiquement les miARNs couplés aux adaptateurs (Figure 31).
Les bandes de gel de polyacrylamide ont ensuite été broyées par centrifugation à 20 000 g pendant 2 min, incubées avec de l’eau ultrapure 2h sous agitation à température ambiante puis passées sur des colonnes à filtre de 0,45 µm et centrifugées 10 sec à 600 g. L’éluat a été incubé avec un mix contenant du glycogène, du NaOAc 3M, un marqueur d’ADN 0.1X (Novagen, Merck millipore, Canada) et de l’Ethanol 100 % puis centrifugé 20 min à 20 000 g à 4°C. Le culot a été lavé à l’éthanol 70 %, centrifugé 2 min à 20 000g puis resuspendu dans 10 mM de Tris-HCl.
La librairie a été validée par électrophorèse en utilisant le kit « High sensitivity D1000 Screentape » (Agilent) sur l’appareil « Tapestation 4200 System » (Agilent).
Les échantillons ont ensuite été quantifiés par fluorescence avec le kit « Picogreen DNA quantification » (Life Technologie) et ont été normalisés à 2 nM.
Les banques « total RNA » et « small RNA » ont ensuite été mélangées et ont subis une étape de dénaturation suivant le protocole « 16s Metagenomic » du kit « MiSeq » (Illumina). Les banques ont été diluées dans un tampon « HT1 » afin d’atteindre une concentration finale de 6 pM. Les banques ont ensuite été séquençées avec l’appareil « NextSeq 500/550 » (Illumina) en utilisant une cassette « High output v2 75 cycles » (Illumina).
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Figure 31 : Profil de migration attendu pour les petits ARN non-codants (microARN) lors du
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Figure 32 : Etape principale du séquençage à haut débit réalisé sur du « Small RNA »
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