Biochimie

A. Western Blot

Les différents types cellulaires, ensemencés en plaque 12 puits à hauteur de 200 000 cellules/puits pour les cellules hépatiques et 180 000 cellules/puits pour les MRC-5, ont été rincés avec du PBS -/- (« Phosphate Buffered Saline, Life Technologies) puis lysés dans un tampon de lyse froid (1% NP40, 10% glycerol, 100 mM Tris pH 8, 100 mM KCl, additionné d’inhibiteurs de protéases et de phosphatases).

4- Dosage BCA

L’extrait de protéine total a été quantifié par dosage colorimétrique BCA avec le kit « Pierce BCA protein assay kit » (ThermoFischer Scientific). La densité optique des échantillons a été mesurée à une longueur d’onde de 562 nm puis comparée à celle des échantillons d’une

97 gamme étalon resuspendue dans le même tampon de lyse, pour déterminer la concentration des échantillons.

5- Electrophorèse sur gel de polyacrylamide

Les lysats cellulaires ont été analysés par électrophorèse dans un gel de polyacrylamide « NuPage 4-12 % Bis-Tris Gel » (Life Technologies). La migration a été effectuée dans un tampon « NuPAGE™ MES SDS Running Buffer » (Life Technologies) pendant 15 min à 50 Volts puis 45 min à 150 Volts. Le transfert a ensuite été effectué sur une membrane de nitrocellulose « Nitrocellulose membrane, 0.45 µM » (Life Technologies) dans un tampon de transfert EtOH 1X pendant 1h à 100 Volts à 4°C. La membrane a été incubée 1h dans un tampon de saturation, TBS (« Tris Buffered-Saline) 1X, 0.1 % Tween (Tween 20, Sigma Aldrich), 5% BSA, puis « overnight », à 4°C, avec les anticorps décrits dans le tableau 9. La membrane a été lavée 3 fois avec du TBS 1X puis a été mise à incuber avec un anticorps secondaire dilués au 1/10 000ème dans le tampon de saturation pendant 1h à température ambiante. La membrane a ensuite été lavée 3 fois au TBS 1X-0.1 % Tween puis révélée par chemiluminescence en utilisant le réactif « Amersham ECL Prime Western Blotting Detection Reagent » (GE healthcare, Little Chalfont, Royaume-Uni). La quantification des bandes protéiques obtenues a ensuite été effectuée avec le logiciel ImageQuant Las4000.

B- Immunofluorescence

Les cellules ont été ensemencées dans des chambres de culture sur lame, de 8 puits « Nunc™ Lab-Tek™ II Chamber Slide™ System » (ThermoFischer Scientific) à hauteur de 12 000 cellules/puits puis traitées dans différentes conditions expérimentales. Les cellules ont été rincées au PBS +/+ (Ca2+ et Mg 2+) puis fixées au Formaldéhyde 4% pendant 10 min à l’abri de la lumière. Les cellules fixées ont été rincées trois fois au PBS +/+ puis perméabilisées avec du méthanol 100% froid pendant 10 min à -20°C. Les cellules perméabilisées ont été rincées trois fois au PBS +/+ puis incubées dans un tampon de saturation (Triton X-114 0.3%, BSA fraction V 10 mg/ml dans du PBS +/+) pendant 1h à 37°C en chambre humide. Les cellules ont ensuite été incubées 1h avec les anticorps d’intérêts (Tableau 9) dilués dans du « DAKO Real Antibody Diluent » (Agilent, Santa Clara CA, Etats- Unis) à 37°C en chambre humide. Les puits ont été rincés au PBS +/+ trois fois puis incubés avec un anticorps secondaire dilué au 1/400ème (Tableau 10) pendant 1h à 37°C en

98 chambre humide à l’abri de la lumière. Les cellules ont ensuite été rincées trois fois avec du PBS +/+ puis le montage de la lame a été réalisé avec du « ProLong™ Gold Antifade Mountant with DAPI » (ThermoFischer Scientific). Les cellules ont été observées au microscope à fluorescence (Zeiss, Oberkochen, Allemagne), avec le logiciel Zeiss Zen (Version 2012) au grossissement 20X et 40X.

C- Proximity Ligation Assay in situ

La technique de « Proximity Ligation Assay in situ » a été réalisée avec le kit « Duolink® In Situ Detection Reagents Orange » (Sigma Aldrich). Après fixation, et saturation, les cellules ont été incubées avec deux anticorps spécifiques d’espèces différentes dilués dans du « DAKO Real Antibody Diluent » (Agilent) 1h à 37°C en chambre humide. Les cellules ont été rincées trois fois au PBS +/+ puis incubés 1h à 37°C en chambre humide avec deux anticorps secondaires couplés à des oligonucléotides « Plus » et « Minus » complémentaires. Trois lavages au PBS +/+ ont été réalisés puis les cellules ont été incubées 30 min à 37°C en chambre humide dans un tampon contenant l’enzyme de ligation permettant la liaison entres les séquences nucléotidiques des anticorps secondaires si la distance est de moins de 40 nm. Les cellules ont été lavées avec le tampon fourni par le kit sur les recommandations du fournisseur puis incubées 1h45 à 37°C en chambre humide à l’abri de la lumière, avec une polymérase et un tampon contenant des oligonucléotides couplés à un fluorophore (Cyanine 3, 594 nm) reconnaissant l’ADN synthétisé par amplification par cercle roulant. Trois lavages avec un tampon fourni par le kit ont été réalisés puis le montage a été réalisé avec du « ProLong™ Gold Antifade Mountant with DAPI ». Les cellules ont été observées au microscope à fluorescence (Zeiss, Oberkochen, Allemagne) avec le logiciel Zeiss Zen (Version 2012) au grossissement 20X et 40X. Le signal a été quantifié avec le logiciel Duolink ImageTool (Sigma-aldrich).

D- Immunoprécipitation d’ARN

Les cellules ont été ensemencées dans des boîtes de Pétri 60 X 15 mm à hauteur de 3 000 000 cellules/puits puis traitées selon différentes conditions expérimentales. Les cellules ont été rincées au PBS -/- froid, « crosslinkées » aux UV avec l’appareil « CL-1000 UV Crosslinking Chamber » (LabX, Midland Canada) à la puisse de 4000 mJ/cm2 et de 2000 mJ/cm2 et lysées dans un tampon « RIP lysis buffer » supplémenté d’inhibiteurs de protéases

99 et de RNAses (Roche). L’immunoprécipitation d’ARN a été réalisée avec le kit « Magna RIP™ RNA-Binding Protein Immunoprecipitation Kit » (Merck milipore, Darmstadt, Allemagne) selon les recommandations du fournisseur. Les billes magnétiques ont été rincées 2 fois avec le « RIP Wash buffer » puis incubées pendant 30 min sous agitation à température ambiante avec 5 µg d’anticorps anti-KSRP (NBP1-18910, Novus), anti-HA (H1847-53C, US biological), anti-Ago2 (ab32381, Abcam) ou anti-ARN double brin (J2, Scicons) ou 5 µg d’anticorps contrôle (IgG purifié) de la même espèce. Trois lavages ont été réalisés puis les billes ont été incubées avec le lysat cellulaire sur la nuit à 4°C, sous agitation. Un volume de 10 µl d’échantillon a été gardé afin de servir de contrôle avant immunoprécipitation « input ». Les billes ont ensuite été rincées 7 fois avec le tampon de lavage en utilisant un support aimanté, puis l’ensemble des échantillons, billes et input, ont été traitées à la protéinase K pendant 30min sous agitation à 54°C. Le surnageant a été récupéré et une extraction au phénol/Chloroforme/alcool isoamylique a été réalisée. Les ARNs extraits ont été précipités à l’éthanol en utilisant des solutions salines ainsi qu’une solution de précipitation fournies dans le kit. Les échantillons ont ensuite été centrifugés à 14 000 rpm pendant 45 min à 4°C, lavés avec de l’éthanol 80% puis centrifugés de nouveau pendant 30 min. Les culots ont été séchés à température ambiante pendant 10 min puis resuspendus dans de l’eau « RNAse free ». Les ARN obtenus ont été quantifiés au NanoDrop 1000 (ThermoFischer).

100 Protéine détectée Référence de l’Anticorps Espèce Dilution Western Blot Dilution Immunofluorescence / PLA

Akt CST 4691 Lapin 1/1000ème 1/400ème

P-Akt CST 4060 Lapin 1/1000ème 1/400ème

KSRP NBP1-18910 Lapin 1/1000ème 1/1000ème

KSRP Ab56438 Souris 1/500ème

GAPDH-HRP

conjugate CST 3683 Lapin 1/1000ème

RXXS*/T* CST 6950 Lapin 1/1000ème 1/400ème

Ago2 ab32381 Lapin 1/200ème

HA US biological

H1847-53C Souris 1/500ème

HA Sigma-Aldrich

H6908 Lapin 1/1000ème

KSRP ab56438 Souris 1/500ème

DROSHA ab12286 Lapin 1/1000ème

ARN double brin Scicons J2 Souris 1/200ème

NS5A Chèvre 1/1000ème

101

Espèce reconnue Référence Dilution Espèce

Lapin-HRP ThermoFischer 1/10 000ème Chèvre

Souris-HRP ThermoFischer 1/10 000ème Chèvre

Souris-AlexaFluor

488nm ThermoFischer 1/400ème Chèvre

Lapin-AlexaFluor

594nm ThermoFischer 1/400ème Chèvre

Tableau 10 : Anticorps secondaires utilisés