A. Y-a-t-il une sélection par la taille des molécules ? Cas d’un mélange complexe

IV. A. Y-a-t-il une sélection par la taille des

molécules ? Cas d’un mélange complexe

Jusqu’à présent, les différentes expériences ont été réalisées systématiquement avec des molécules d’ADN très homogènes en taille. Nous souhaitons déterminer désormais quelle est l’influence de la taille des molécules sur le processus d’assemblage et par exemple savoir si la technique d’assemblage capillaire utilisée pourrait induire une sélection en taille des objets. Pour répondre à cette question, nous avons utilisé exactement le même protocole expérimental (vitesse substrat de 1mm/sec), mais cette fois-ci en assemblant une goutte de molécules d’ADN en suspension ayant subi des ultrasons pendant 10 secondes. De cette façon on espère obtenir une solution de molécules d’ADN phage lambda avec des longueurs hétérogènes, composée de molécules cassées mécaniquement à des endroits aléatoires.

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Figure 9. Images en fluorescence des résultats obtenus après assemblage d’une solution d’ADN hétérogène

(solution d’ADN agitée aux ultra-sons pendant 10s) sur un timbre en PDMS et transfert de l’assemblage sur une lamelle de verre APTES (v=1mm/sec, T°substrat=25°C, [C]TritonX-100=1%v/v).

Après assemblage de cette solution d’ADN hétérogène et transfert de l’assemblage sur une surface recouverte d’une couche moléculaire d’APTES, la figure 9 montre que nous obtenons un réseau avec un taux de remplissage moindre (85 sites occupés sur 100), et sur un même champ, l’assemblage de molécules d’ADN de tailles différentes. A l’échelle micrométrique, il ne semble donc pas qu’il y ait une sélection par la taille des pelotes d’ADN par assemblage capillaire. Le résultat visible à l’image rend compte de la composition de la solution initiale composée d’une multitude de tailles variables. Il est à noter qu’à partir d’une minute d’ultrasons, on n’assemble plus aucune molécule. Ces observations s’appliquent donc ici dans la limite de fragments d’ADN micrométriques assemblés sur des motifs micrométriques. Schwartz et al. ont réalisé une puissante étude en imageant de longues (plus de 100 kbp) molécules d’ADN uniques peignées sur une surface de verre et digérées par des enzymes de restriction [38-39]. Le fait d’étirer et d’accrocher les molécules d’ADN sur une surface en verre permet une cartographie linéaire de la position spatiale vs la position génomique, et conserve l’information haplotypique. Néanmoins, la technique de Schwartz souffre d’un étirement inhomogène dû aux interactions de surface. De plus, les molécules d'ADN peignées conservent un grand nombre de points d'ancrage à la surface après leur réhydratation, et l'activité enzymatique est très perturbée au

voisinage de ces points [40]. Il est clair qu’une solution pour palier à ce problème serait de réaliser ces études en solution plutôt qu’en surface. Une alternative intéressante pour la réalisation d’une cartographie génique, serait de faire circuler des molécules d’ADN fluorescentes linéaires et uniformément étirées au travers de nanocanaux. Une autre alternative serait de réaliser la réaction en solution puis d’assembler la solution résultante par assemblage capillaire. Ainsi, dans cette perspective, nous avons, pour l’heure, souhaité démontrer que la technique d’assemblage capillaire permet de rendre compte de l’état d’une solution après assemblage. En d’autres termes, prouver que si l’on part d’une solution complexe, on peut retrouver après assemblage et après transfert,

4 µm 4 µm _{4 µm}

Figure 10. Gel d’électrophorèse d’ADN phage

lambda après digestion par l’enzyme SmaI (à droite) et non digéré (à gauche) donné en référence.

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un résultat qui rende compte de l’état de la solution initiale.

Ainsi, nous avons assemblé une solution d’ADN phage lambda digéré par action enzymatique. Nous avons choisi une enzyme (SmaI) qui clive spécifiquement l’ADN phage en deux sites bien connus et identifiés au préalable.

Le gel d’électrophorèse (figure 10) de l’ADN phage lambda digéré pendant 3 heures par l’enzyme SmaI par rapport à la migration de l’ADN non digéré de référence, témoigne d’une part de la bonne activité de l’enzyme et montre d’autre part les trois tailles que l’on s’attend à obtenir après digestion : une population de molécules de 8 kbp soit 2,4 µm, une population de molécules de 12 kbp soit 3,7 µm et une population de molécules de 28 kbp soit 8,6 µm. La solution d’ADN se retrouve donc trois fois plus concentrée après digestion. Nous avons donc dilué cette solution de façon à respecter les conditions expérimentales d’assemblage de molécules uniques décrites dans le chapitre II (concentration de 10 µg/ml) puis avons ensuite marqué l’ADN en fluorescence avec un intercalant (YOYO-1).

2 4 6 8 10 0 5 10 15 20 25 C o un ts (a .u .) Length (µm) Fr équ e nce ( u .a .) Longueur (µm)

Figure 11. Images en fluorescence des résultats obtenus après assemblage d’une solution d’ADN phage lambda

digérée par une enzyme de restriction (SmaI) sur un timbre microstructuré et transfert (v=1mm/sec, T°substrat=25°C, [C]ADN=10µg/ml, [C]TritonX-100=1%v/v).

Les images en fluorescence de la figure 11, montrent que l’on obtient après assemblage un réseau de molécules de tailles variables. L’histogramme en bas à gauche de la figure nous apprend que ces tailles correspondent aux tailles attendues (2,40 µm ± 0,24 µm, 3,96 µm ±

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0,24 µm et 8,68 µm ± 0.24 µm en moyenne). Une autre question à laquelle nous avons voulu répondre par le biais de cette expérience est savoir si lorsque les molécules sont plus petites, elles subissent également le surétirement observé dans le cas de l’ADN de phage lambda. Or, ces résultats ne sont pas suffisants pour apporter des éléments de réponse concluants à cette question. En effet, les populations de 2,4 µm de long théoriques mesurent autour de 2,4 µm de long également après assemblage et les populations de 3,7 µm ou de 8,6 µm de long théoriques mesurent autour de 4,0 µm et 8,8 µm en longueur après assemblage, ce qui correspond à un surétirement de 8% et de 2,3 % respectivement. On peut peut-être se demander si l’action enzymatique a un effet sur l’étirement final des molécules dans ce cas en particulier. Cependant, il faudra réaliser un plus grand nombre d’expériences avant de pouvoir se prononcer sur ce point. Il sera notamment intéressant de vérifier si les proportions des populations sont conservées après assemblage, sur la base d’une étude plus statistique. Finalement, on peut dire que le résultat obtenu après assemblage puis transfert est représentatif de la solution initiale. Là encore, on observe que la technique d’assemblage capillaire n’induit pas de sélection par la taille et permet donc un assemblage fidèle des objets en solution. Cette donnée est importante car suivant les applications, on peut être amené à manipuler des solutions complexes et hétérogènes, avec des objets de plusieurs tailles en solution et il ne faut pas que la présence des autres objets empêche l’assemblage des objets d’intérêt. Cependant, pour cette expérience, on ne retrouve pas le surétirement notable observé dans le cas de l’ADN de phage lambda.

IV. B. Assemblage de molécules d’ADN plus courtes :