Etat de l’art : méthodes d’étirement de la molécule d’ADN

La fabrication de réseaux ordonnés de molécules d’ADN sur une surface est importante pour le développement de biocapteurs pour le diagnostic [5], et pour le développement de dispositifs dédiés à l’électronique moléculaire [6]. L’ADN est un matériau très prometteur pour construire des puces avec une précision nanométrique en raison de ses capacités de reconnaissance, de sa stabilité physicochimique, et de sa rigidité mécanique [7, 8-10].

Les puces à ADN sont une nouvelle technologie répandue et puissante qui promet d’être largement utilisée en biologie moléculaire et en médecine dans les années à venir. A l’échelle de la molécule unique, l’ADN a déjà été peigné pour le séquençage du génome [11] et pour le diagnostic médical [12]. Cependant, la tendance actuelle est d’être capable d’organiser des molécules d’ADN individuelles peignées en réseaux réguliers afin de pouvoir effectuer une lecture optique rapide et performante. Dans un autre contexte, la fabrication de cet assemblage contrôlé pourrait servir de base ou support pour la construction des dispositifs du futur. En effet, les chaînes d’ADN peuvent être métallisées [13-17], ou fonctionnalisées avec des nanoparticules [18], et cette capacité à fabriquer des structures nanométriques à 1D de façon contrôlée à des endroits prédéfinis d’un substrat pourraient laisser entrevoir la fabrication d’assemblages plus complexes.

Aussi bien pour le séquençage que pour des applications d’assemblage supramoléculaire, il est nécessaire de déplier l’ADN et de l’immobiliser sur une surface. Dans la littérature, de nombreuses études portant sur le peignage moléculaire ont été conduites [19-21]. La technique de " peignage moléculaire ", introduite en 1993, consiste à obtenir à partir de la molécule d'ADN en " pelote ", forme sous laquelle elle se trouve naturellement en solution,

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des filaments alignés et étirés, beaucoup plus faciles à étudier que sous leur forme compactée. Cette technique permet d'étirer parallèlement un grand nombre de molécules d'ADN sur une surface. Le peignage est une technique simple à mettre en œuvre puisqu'il ne requiert aucune modification chimique des molécules d'ADN. En pratique, une lame de verre traitée chimiquement est plongée dans une solution contenant les molécules d'ADN. Chaque molécule se fixe à la lame par l'une de ses extrémités. La surface de verre est ensuite lentement retirée et ce mouvement provoque, par capillarité, l'étirement des molécules qui se collent à la lame, sous forme de fils étirés de même orientation.

Figure 2. A gauche,image en fluorescence de molécules d’ADN de phage marquées en fluorescence puis

peignées sur des surfaces traitées à l'aide de dérivés du silane. Le champ de vue photographié à l'aide d'une caméra intensifiée contient une majorité de segments de 25 µm environ. Les fragments plus petits sont dus à des cassures aléatoires qui ont lieu avant ou lors de la préparation. La barre d’échelle correspond à 10 µm. A droite, exemple de cartographie physique sur ADN peigné [20].

Ainsi, certains groupes de recherche ont mis au point des étirements de brins d’ADN sur des surfaces de différentes natures [22-25] dans le but de pouvoir les analyser par la suite, ou dans le but de réaliser des puces à ADN (figure 2). Les brins d’ADN ont été séparés grâce à des nanopiliers sous un champ électrique [26]. L’ADN a également été peigné en faisant circuler une solution d’ADN au travers de canaux microfluidiques [27]. Opitz et al. ont peigné les molécules d’ADN en les accrochant à des motifs chargés positivement [28]. D’autres groupes de recherche ont peigné les molécules d’ADN sur des substrats en PDMS modifiés ou non modifiés [29-32]. Cependant, la plupart du temps, les molécules sont peignées aléatoirement sur la surface sans origine prédéterminée et ne sont donc pas distribuées de façon contrôlée comme le montre la figure 2. Ceci constitue un réel inconvénient pour une exploitation compétitive de ces lames.

Guan et Lee ont été les premiers à générer des réseaux ordonnés de molécules d’ADN peignées sur une surface [32]. Dans cette étude, ils mettent en contact manuellement un timbre en PDMS structuré par lithographie avec une goutte d’ADN en solution. Ensuite, ils exercent une pression à l’arrière du timbre pendant quelques secondes et le retirent (figure 3). Enfin, les molécules sont transférées depuis ce timbre vers une lame de verre ou de mica. Cependant, dans cette référence, les molécules d’ADN finalement assemblées ne sont pas uniques et la technique présente l’inconvénient d’être manuelle donc difficilement contrôlable et reproductible. Le non contrôle précis du nombre de molécules d’ADN déposé par site rend impropre cette méthode pour un grand nombre d’applications en biologie. En revanche, ce travail nous a orientés vers la piste de l’assemblage capillaire sur des timbres de PDMS puis leur transfert par contact printing.

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B.

C. D.

A.

Figure 3. A. Schéma explicatif du peignage de l’ADN selon le protocole de Guan et Lee [32]. B. Image de

fluorescence d'un réseau de brins d’ADN. C et D. Images MEB de molécules d'ADN suspendues au dessus des structures du timbre de PDMS.

L’assemblage capillaire constitue ici une alternative attrayante à ces études car elle permet de contrôler les paramètres expérimentaux avec une grande finesse et précision. Dans le cas des applications génomiques par exemple, où des molécules uniques sont requises, le contrôle des paramètres expérimentaux permettant des évènements d’adsorption de molécules uniques, est crucial. Nous avons donc adopté la stratégie présentée dans le chapitre 2 section II, combinant la lithographie douce et l’assemblage capillaire.

Deux facteurs importants sont indispensables pour fabriquer et caractériser des réseaux ordonnés d’ADN : le substrat d’accueil doit être atomiquement plan de façon à pouvoir distinguer les motifs d’ADN et les nanostructures d’ADN doivent être positionnées de façon précise sur une large étendue tout en assurant leur immobilisation. Pour le substrat, notre choix s’est porté sur la silice avec une fonctionnalité amine et chargée positivement (couche moléculaire d’APTES) de manière à ce que l’accroche des molécules s’établisse de façon électrostatique en raison de la forte densité de charges négatives portées par l’ADN. Les substrats que nous avons utilisés sont soit du silicium oxydé, ou des lamelles de verre recouvertes par une monocouche moléculaire d’APTES, soit du mica, substrat bien adapté à l’imagerie par AFM.

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