A. La fonctionnalisation chimique de surface

a modification idéale des propriétés chimiques superficielles d’un substrat passe souvent par le dépôt d’un film monomoléculaire. Cette méthode présente l’avantage d’être compatible avec de nombreux procédés de microfabrication.

Les films monomoléculaires auto-organisés ou SAMs (Self-Assembled Monolayers) sont fixés de manière covalente à la surface par chimisorption ce qui leur confère une forte résistance. Ils peuvent être réalisés par dépôt en phase liquide ou en phase gazeuse. La formation de ces films moléculaires est gouvernée par une thermodynamique assurant la formation de monocouches stables et solides. Sur une surface plane et bien préparée, ils présentent l’avantage de former des revêtements homogènes quasiment exempts de tout défaut de couverture. On obtient ainsi des zones dont la réactivité chimique peut être contrôlée par le choix des molécules greffées. Combinée aux méthodes de lithographie, la fonctionnalisation des surfaces par des monocouches moléculaires permet la réalisation de surfaces présentant des contrastes chimiques abrupts. On parle alors d’ingénierie chimique des surfaces. Les molécules utilisées pour former ces couches possèdent une structure permettant un greffage covalent à la surface du substrat. On parle de groupement d’accroche ou de tête greffante, un arrangement ordonné sur la surface par interactions de Van der Waals entre les chaînes alkyles -(CH

2)

n- ou fluorés (-(CF

2)

n-) qui les constituent, et

l’apparition d’une terminaison chimique contrôlée, située à l’opposé de la tête greffante

contrôle la réactivité finale du substrat revêtu (voir fig. 1). Le contrôle de la longueur de la chaîne reliant la tête greffante au groupement de surface permet d’ajuster l’épaisseur de la couche produite ainsi que l’éloignement du groupe de surface par rapport à la surface (ingénierie des encombrements stériques).

Figure 1. Schéma présentant le greffage de molécules de type alcane formant des SAMs

Les interactions d’accroche sur le substrat sont de différents types : on peut citer à titre d’exemple la réaction des thiols (R-SH) avec une surface métallique telle que l’or mais aussi les réactions de silanisation qui permettent l’accroche de molécules appelées silanes possédant un atome de Si avec des surfaces terminées par des groupements hydroxyles (–OH).

39

Les substrats SiO

2 ou Si étant favorables à la présence de groupements hydroxyles, les silanes sont les candidats idéaux pour traiter les lames de verre de la

biologie ou les substrats monocristallins de la microélectronique. Comme cela est illustré sur la figure 2, R

n (avec n = 1, 2, 3) est soit un groupement d’accroche facilement hydrolysable qui servira à la création de liaisons Si-O-Si utiles au greffage des molécules sur la surface, soit un groupe alkyl quelconque (-C

nH

2n+1) n’entrant pas

en jeu dans l’étape de greffage.

Selon le nombre de groupements hydrolysables nous parlons de molécules tri- (trois groupements hydrolysables), bi- (deux groupements hydrolysables) ou monofonctionnelles (un seul groupement hydrolysable). La différence entre ces trois groupes de silanes est le nombre de liaisons covalentes possible entre la

molécule et la surface ou entre les molécules entre elles au cours du greffage. On comprend facilement que le greffage sera d’autant plus robuste que chaque liaison sera énergétique et que leur nombre sera grand.

Les silanes majoritairement utilisés pour fonctionnaliser les surfaces de SiO

2 sont les trichlorosilanes (R 1 = R 2 = R 3 = Cl), les triméthoxysilanes (R 1 = R 2 = R 3 = OCH 3) et les triéthoxysilanes (R 1 = R 2 = R

3 = OC2H5). De chacune de ces trois catégories, les silanes que nous avons utilisés dans le cadre de cette thèse sont l’OctadécylTrichloroSilane (OTS), le 3-Glycidoxypropyl-trimethoxysilane (silane époxyde) et le (3-AminoPropyl)TriEthoxySilane (APTES) respectivement.

En effet, l’OTS est un alkylsilane ayant une longue chaîne aliphatique (18 atomes de carbone) dont la terminaison méthyle permet de passiver les surfaces en leur conférant un caractère hydrophobe (angle de contact égal à 110°). De plus, la faible énergie de liaison Si-Cl (Eliaison

(Si-Cl) = 380 kJ/mol) confère à cette molécule silane l’avantage de subir une condensation plus rapide et meilleure sur les surfaces de SiO

2 : les surfaces ne présentent donc aucun comportement à dépendance temporelle. Cependant, les molécules d’OTS ont tendance à diffuser et la forte réactivité de la liaison Si-Cl à l’hydrolyse rend l’OTS très sensible aux traces d’eau. En ce qui concerne le silane époxyde, malgré une Eliaison (Si-O) = 110 kJ/mol <

Eliaison (Si-Cl), l’élaboration de monocouches d’époxyde a l’avantage d’être facilement

reproductible et s’avère en pratique moins délicate que celle d’OTS. Finalement, l’APTES quant à lui est un silane trifonctionnel constitué de trois groupements d’accroche éthoxy (– OC2H5) qui permettent d’assurer un greffage solide sur les surfaces de SiO

2. En effet, aussi bien la déformation structurelle que la diffusion des molécules d’APTES sont moindres que celles des molécules d’OTS. De façon générale, les surfaces auto-assemblées d’APTES sont donc de meilleure qualité.

Au niveau dimensionnel, les molécules d’OTS mesurent 2,5 nm de long, les silanes APTES 0,7 nm et les silanes époxyde 1 nm environ.

Pour la partie concernant l’assemblage de cellules dans laquelle on souhaite organiser des cellules individuelles par dépôt sélectif sur une surface (Chapitre 3), nous avons opté pour une double fonctionnalisation chimique du substrat d’accueil :

- un traitement chimique de la surface permettant de créer des zones répulsives où le dépôt sera interdit. Cette modification chimique de la surface doit donc avoir lieu sur toute

Figure 2 Formule générale

d’un silane

C

C

Figure 2. Formule générale

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l'étendue du substrat, à l'exception des zones où l'on veut que les bioentités se déposent préférentiellement.

- une adaptation chimique localisée afin de créer une affinité entre le ligand ciblé et la zone où l'on souhaite déposer les bioentités. Nous devons donc choisir une chaîne R’ et un groupement de surface qui favorise l’accroche des ligands.

(a) Microcontact

printing d’OTSsur une surface SiO2

(b) Dépôt d’OTS: revêtement antiadhésif de la surface sauf aux endroits des motifs

(c) Silanisation des motifs

avec un silane affin vis-à-vis des entités à localiser

Molécule d’accroche

OTS

Revêtement assurant une fixation préférentielle Revêtement répulsif

(d) Substrat d’accueil

comportant une double fonctionnalisation de surface

Schéma 1. Procédé expérimental retenu pour une double fonctionnalisation de la surface d’accueil à l’aide du

microcontact printing.

De part les propriétés et les caractéristiques des silanes présentées précédemment, nous avons choisi de les utiliser de la façon suivante :

Pour la zone répulsive :

ƒ l’OTS que l’on déposera par microcontact printing Pour la zone d’accroche :

ƒ le silane terminaison amine (APTES). Le groupement amine (NH₂) de l’APTES a une affinité pour les groupements aldéhyde (CHO) de certaines biomolécules, et est chargé positivement en solution pour un pH<pKa du couple NH3⁺/NH2 soit pH< 9,5, il peut donc assurer une accroche électrostatique avec des bioentités chargées négativement

OU

ƒ le silane terminaison époxyde, la terminaison époxyde présentant une affinité pour les groupements aminés des biomolécules.

Pour la zone d’accroche, nous avons également exploré la possibilité d’utiliser des biomolécules, plus particulièrement le couple biotine/streptavidine.

La biotine, mieux connue sous le nom “vitamine H”, est une molécule biologique de 13 kDa qui mesure 1 nm-1,2 nm environ. On la trouve

recroquevillée (en pelote) à l’état naturel (Figure 3).

La streptavidine, quant à elle, est une protéine d’une masse moléculaire de 60 kDa obtenue à partir de la bactérie Streptomyces avidinii. Sa forme ressemble à un sablier mesurant 54x58x48 Å environ. La molécule est un homo-tetramère dont toutes les sous-unités peuvent faire la liaison avec une seule molécule de biotine à la fois (Figure 4).

Figure 3. Structure

chimique d’une moléculede biotine.

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La streptavidine est le plus souvent marquée avec des fluorochromes pour une détection par microscopie en fluorescence.

Le couple streptavidine-biotine est devenu un modèle communément utilisé pour la reconnaissance moléculaire en raison des propriétés particulières des deux molécules :

1. La liaison une fois formée est très robuste et stable.

L’affinité entre ces deux molécules biologiques est très élevée (la constante d’association est d’environ 10¹⁵ M^-1).

2. Il est facile de produire des dérivés biotine; dans notre cas, nous avons utilisé l’ester de la N-hydroxysuccinimide (NHS) biotine comme agent de biotinylation. Ce produit réagit avec les amines primaires (N terminal) des protéines de façon covalente. 3. La streptavidine possède quatre sites de liaison pour la biotine, deux par côté, qui

permettent d’utiliser cette molécule pour la liaison en croix des dérivés biotine. Pour la zone d’accroche, aussi bien les silanes que les biomolécules seront déposés par incubation (Schéma 1).

I. B. Une technique de lithographie douce : le