Ségrégation/kanamycine autofécondation

plantes T1

sensibles à la kanamycine

plantes T1

résistantes à la kanamycine

graines T2

crible in vitro

Ségrégation/kanamycine

autofécondation

graines T3

autofécondation

Etude du mode d’action et modification de PsTI

140 2.3.2. Transformation d’Arabidopsis thaliana et obtention de lignées

homozygotes

L’écotype Wassilevskija (WS) d’Arabidopsis thaliana a été transformé selon le protocole décrit par Clough et Bent (Clough, 1998). Les fleurs d’A. thaliana âgées de 2 à 3 semaines sont trempées pendant 2 min dans une solution de saccharose à 5% et de Silwet L-77 à 0,03% contenant la suspension de bactéries issues d’une culture de densité optique de 0,8 à 600 nm en milieu LB additionné de gentamycine (20 mg.l^-1), de rifampicine (50 mg.L^-1) et de kanamycine (50 mg.l^-1).

Les graines des plantes ayant subi la transformation sont récoltées. Elles sont stérilisées pendant 5 à 10 min dans une solution contenant 90% d’éthanol et 10% d’une solution de Barychlor® (un comprimé pour 40 ml d’eau) sous agitation. Les graines sont ensuite rincées dans de l’éthanol absolu, puis mises à sécher toute la nuit en conditions stériles. Elles sont ensuite semées sur un milieu de culture (annexe 4) contenant 100 µg.ml^-1 de kanamycine afin de sélectionner les transformants primaires. Après 2 à 3 semaines de cultures in vitro, les plantes résistantes à l’antibiotique sont repiquées dans du terreau puis transférées en serre. Les graines T2 issues de l’autofécondation des transformants primaires sont semées sur un milieu sélectif contenant 100 µg.ml-1 de kanamycine afin de sélectionner les lignées présentant une ségrégation 3:1 (KanaR: Kana S) caractéristique de l’insertion du ou des ADN-T à un seul locus dans le génome. Afin d'acquérir des lignées ADN-T3 homozygotes, huit plantes Kana^R (pour chaque lignée T2 sélectionnée) sont transférées en serre afin d’obtenir les graines issues de l’autofécondation. Ces graines sont à nouveau semées sur milieu sélectif et les lignées homozygotes pour la résistance à l’antibiotique sont sélectionnées (figure 3.10).

2.3.3. Détermination du nombre d’insertion de l’ADN-T par Southern-blot.

Ces expériences n’ont été menées que pour les lignées exprimant PsTI.

2.3.3.1.Extraction d’ADN génomique

L’ADN génomique est extrait selon le protocole de Doyle et Doyle (1990), 0,5 à 2 g de matériel végétal est broyé au mortier en poudre fine dans l’azote liquide. La poudre est transférée dans un tube dans lequel est ajouté 7,5 ml de tampon d’extraction CTAB (CTAB 2% (w/v) ; NaCl 1,4 M ; EDTA 20 mM ; Tris-HCl 100 mM pH 8 ; β-mercaptoéthanol 0,2%

(v/v)) préalablement chauffé à 60°C. Après 30 minutes d’incubation à 60°C, 7,5 ml d’un mélange chloroforme:alcool isoamylique (24:1) est ajouté. Le mélange est ensuite centrifugé (10 min à 4100 g). La phase aqueuse contenant les acides nucléiques est reprise et additionnée de 6 ml d’isopropanol avant de subir une nouvelle centrifugation (20 min à 8000 g). Le culot d’ADN est lavé avec un mélange d’éthanol 76% et d’acétate d’ammonium 10mM, puis centrifugé (5 min à 8000 g). L’ADN est repris dans 500 µl de tampon TE (Tris-HCl 10 mM pH 8 ; EDTA 1 mM pH 8). L’ADN est précipité une nouvelle fois avec 50 µl d’acétate de sodium 3 M et 500 µl d’isopropanol puis centrifugé (5 min 8000 g). Après un dernier rinçage à l’éthanol 70%, le culot est séché et repris dans 100 µl de tampon TE par gramme de tissus végétaux de départ.

2.3.3.2. Analyse en Southern Blot

Un microgramme d’ADN génomique est digéré par 5 unités d’endonucléase de restriction

XbaI dans le tampon du fabricant, en présence de spermidine 5 mM. Les produits de digestion

sont séparés sur gel d’agarose à 1,2%. Après électrophorèse toute la nuit à 30 mV, Les molécules d’ADN sont dépurinées par un traitement de 15 minutes dans un bain de HCl 0,15M. Le transfert alcalin sur membrane de Nylon Hybond N+™ (Amersham) est réalisé avec une solution de NaOH 0,4 N pendant 4 à 6 heures. La membrane est rincée dans une solution de 2X SSC (NaCl 300 mM ; Tris-sodium citrate 30 mM) pendant 5 minutes, la membrane est conservée à 4°C jusqu’à l’hybridation.

L’hybridation est réalisée selon le protocole décrit par Church et Gilbert (1984). La membrane est pré-hybridée pendant 3 à 4 heures à 65°C avec la solution d’hybridation (SDS 7% ; Na2HPO4 0,25 M pH 7,4 ; EDTA 2mM ; Héparine 200 µg.ml^-1 ; ADN de sperme de saumon soniqué et dénaturé 100 ng.ml^-1). La sonde PsTI obtenue par PCR et marquée au α-32P avec le kit de marquage aléatoire (Promega) selon les conditions recommandées par le fournisseur est ajoutée après dénaturation alcaline. L’hybridation s’effectue pendant 16 heures, à 65°C, sous agitation.

La sonde radioactive en excès est éliminée par une succession de 2 rinçages à 65°C avec une solution de 1X SSC/0,1% SDS puis avec un solution de 0,1X SSC/0,1% SDS. La membrane est ensuite placée dans une cassette d’autoradiographie en contact avec le film Kodak X-Ray et placée entre 2 écrans intensificateurs à –80°C. Le film est développé après 4 jours d’exposition.

Etude du mode d’action et modification de PsTI

142 2.3.4.Etude de l’expression du transgène

Afin de quantifier l’expression de PsTI dans les lignées recombinantes par analyse en Dot-blot, les protéines solubles sont extraites de 300 µg de parties aériennes des plantes avec 500 µl de tampon d’extraction (Tris-HCl 100 mM pH 7,6 ; EDTA 50 mM ; NaDETC 0,5% (w/v) ; PVPP 10%) après broyage dans l’azote liquide. Après centrifugation (15 min, 8000g, 4°C), les protéines sont quantifiées selon la méthode de Bradford (1976).

Une quantité croissante d’extrait végétal (1 à 10 µg) ainsi que la protéine PsTI pure (50 à 1000 ng) sont diluées dans 100 µl de tampon d’extraction. Le transfert des protéines sur une membrane de nitrocellulose Hybond-C (Amersham) est réalisé au moyen du Bio-Dot® (Bio-Rad) en condition semi-sèche d’après le protocole préconisé par le fournisseur. La membrane est incubée 1 heure dans une solution PBS contenant 0,5% de Tween 20 et 5% de BSA (PBS-T-BSA) afin de masquer les éventuels sites non spécifiques. La membrane est ensuite mise en présence de l’anticorps anti-PsTI dilué au 1/1000ème dans la solution PBS-BSA pendant 1 heure à température ambiante puis toute la nuit à 4°C. Après 3 rinçages de 5 minutes à température ambiante avec une solution de PBS-T, l’anticorps secondaire couplé à la péroxydase (anticorps polyclonal anti-lapin, Sigma) est dilué au 1/10000^ème dans la solution de PBS-T. L’incubation se déroule pendant 1 heure à température ambiante. Cette étape est suivie de 3 lavages de 5 minutes avec la solution de PBS-T. La révélation est ensuite réalisée au moyen des réactifs Covalight A et B (Valbiotech) selon les consignes du fabricant. Les signaux sont visualisés après exposition d’un film Kodak X-Ray.

2.3.5. Quantification du niveau d’expression de PsTI.

Les niveaux d’expression des lignées ont été estimés grâce au logiciel Molecular Analyst v.2.1.1. software (Bio-rad), par une analyse densitométrique du film autoradiographique obtenu lors de l’analyse en Dot-Blot. L’intensité des signaux obtenus pour les différentes lignées transgéniques est comparée à l’intensité des signaux correspondants à des quantités de PsTI connues.