élution par dénaturation et compétitionSep-Pack C18

Gel filtration (P4)

100°, 10 min

Affinité,

élution par dénaturation et compétition

Sep-Pack C18

Utilisation et diversification des inhibiteurs de protéases à cystéines

114 Š Par affinité

La chromatographie d’affinité a souvent permis l’isolement d’inhibiteurs de protéases avec un taux de purification élevé. L’extrait est déposé sur une colonne d’affinité composée d’une matrice de papaïne carboxyméthylée. Après lavage, le déplacement des sites est effectué pendant 1h à température ambiante dans un tampon constitué de E64 10µM ; Tris 20 mM pH 10,3 ; DMSO 20% puis les protéines affines sont éluées de la colonne.

Après élution, les fractions obtenues sont déposées sur électrophorèse SDS-PAGE afin de contrôler la présence de l’IP. Après coloration au bleu de Coomassie (figure 2.8), une seule bande est observée. Cette protéine présente une masse moléculaire apparente de 11 kDa, ce qui est en accord avec les résultats obtenus précédemment.

La séparation des molécules, issues du broyage des pucerons dans le méthanol 50%, sur mini-colonne en phase inverse puis sur gel filtration permet d’enrichir en protéine et d’éliminer toutes les molécules interférentes avec l’analyse de l’activité IP à cystéine. La purification de l’activité IP à cystéine a ensuite été envisagée selon plusieurs techniques mais seule l’affinité a permis d’obtenir un peptide de 11 kDa à homogénéité.

3.4.3. Microséquençage

Après électrotransfert des protéines du gel SDS-PAGE obtenu après chromatographie d’affinité sur membrane de PVDF, la bande d’intérêt est découpée et le séquençage effectué par la société Génosphère Biotech en vue d’obtenir la séquence N-terminale du peptide. Les quantités molaires d’acides aminés successives obtenues au cours du séquençage ont été très faibles, malgré l’envoi d’un spot significativement coloré au bleu de Coomassie. Une séquence de douze acides aminés a tout de même été obtenue : (A/E/S) A E A S L x K G Q x L.

Les alignements réalisés avec cette séquence contre le génome de la drosophile révèlent quelques hits faiblement significatifs avec des ORF de petit poids moléculaire, dont :

- 1 : une protéine de 139 acides aminés (Q9VG63), homologue d’un inhibiteur de phosphatase (I-T protein) étudié chez la drosophile (Q9VGJ2). Le hit ne se trouve pas en région N-terminale de cette protéine (segment 89-100) et présente 75% d’homologie (50% d’identité).

query : AAEASLxKGQxL Q9VG63 : ⁰⁸⁹AAEFTITRGQKL¹⁰⁰ Q9VGJ2 : ¹²⁵EAEFTICKGHKL¹³⁵

- 2 : une protéine de 119 acides aminés présentant une faible homologie si les x représentent des cystéines. C’est un peptide de la famille des CHH (Crustacean Hyperglycemic Hormone).

query : AAEASLCKGQCL Q95SV5 : ⁶⁶TSIHRLCKKDCF⁷⁷

Toutefois le spectre obtenu après hydrolyse ne reflète qu’une quantité infime de protéines, en regard de l’intensité de la coloration au bleu de Coomassie (figure 2.8). La protéine majoritaire pourrait donc présenter un N-terminal bloqué. Des coupures de la protéine au CNBr ont donc été effectuées afin d’obtenir des peptides internes mais sans succès. Si dans le mélange co-existent deux espèces protéiques (une minoritaire, séquençée, et une majoritaire, bloquée en N-terminale), ces deux protéines ne semblent donc pas présenter de méthionines accessibles.

Ces résultats ne permettent malheureusement pas de lever l’incertitude sur la nature de l’activité IP à cystéine : est-ce que ce peptide de 11 kDa présente des homologies avec un peptide présent dans l’hémolymphe des arthropodes dont la fonction a dérivé à partir des fonctions des deux protéines décrites ci-dessus (la fonction hormonale ou la fonction inhibitrice d’une autre enzyme), ou est-ce une cystatine ou une protéine inhibitrice d’une autre famille, bloquée en N-terminal ?

Utilisation et diversification des inhibiteurs de protéases à cystéines

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Conclusions

Cette étude montre que l’hémolymphe de puceron contient un inhibiteur de protéase à sérine (trypsine) et un inhibiteur de protéase à cystéine. Ces deux molécules présentent des masses moléculaires apparentes de 13 et 11 kDa respectivement. Elles semblent majoritairement présentes dans l’hémolymphe.

L’inhibiteur de protéase à sérine pourrait remplir le rôle de régulateur des voies d’immunoréactivité humorale comme cela a été montré chez d’autres insectes.

Peu d’inhibiteurs de protéases à cystéine ont été mis en évidence dans l’hémolymphe d’insecte et leur rôle n’est pas très développé dans la littérature. Nos résultats montrent que les IP de l’hémolymphe sont actifs sur les protéases digestives du puceron. Or l’activité protéolytique du tube digestif est due à une activité protéase à cystéine. C’est pourquoi l’IP à cystéine nous a particulièrement intéressé. Bien que la séquence ne soit pas encore disponible, les différentes stratégies que nous avons développées pour purifier cet IP, ont révélé quelques caractères physico-chimiques particuliers de cette protéine. C’est un peptide qui présente une masse moléculaire de 11 kDa et qui s’avère être très stable. Ce peptide est résistant à la chaleur, c’est une protéine soluble et relativement apolaire puisqu’elle ne précipite pas dans le méthanol 50%.

Récemment, un inhibiteur de protéase à cystéine a été isolé de l’hémolymphe du ver à soie (Yamamoto, 1999 a). C’est également une protéine de petit poids moléculaire (10,5 kDa) et résistante à la chaleur. Sa particularité est qu’elle présente une faible homologie avec les cystatines, mais la séquence de ce peptide est très homologue aux proséquences de plusieurs précurseurs de protéases à cystéine (Yamamoto, 1999 b).

On ne peut pas écarter la possibilité de l’existence d’une telle protéine dans l’hémolymphe du puceron. Elle expliquerait en outre l’échec des PCR recherchant des homologues de cystatines dans la banque de puceron. C’est pourquoi, une nouvelle préparation de l’inhibiteur de protéase à cystéine est nécessaire afin d’effectuer un microséquençage interne (après digestion trypsique par exemple, si elle est effective). De nouveaux oligonucléotides pourront être définis afin de cloner l’ADNc. Le peptide pourra être exprimé en système hétérologue et son pouvoir entomotoxique contre les pucerons pourra être évalué en nutrition artificielle, comme nous l’avions prévu initialement.

CHAPITRE III

ETUDE DU MODE D’ACTION