Les inhibiteurs de protéases chez les insectes 1. Les inhibiteurs de protéases à sérine

Les informations concernant le rôle physiologique des inhibiteurs de protéases chez les insectes reposent surtout sur l’étude des inhibiteurs de protéases à sérine. Il existe quatre familles d’inhibiteurs de protéases à sérine chez les insectes :

- la famille des serpines dont les membres possèdent un poids moléculaire d’environ 40 kDa ;

- la famille des « Kunitz inhibitors » comprend des protéines plus petites (10 kDa environ) (pour revue : Polanowski, 1996) ;

- la famille des « Locusta inhibitors» ; ces protéines isolées chez le criquet sont des peptides de 35 acides aminés possédant une activité antichymotrypsine et/ou prophénoloxydase (Boigegrain, 2000 ; Kanost, 1999) ;

- enfin, la famille des « Ascaris inhibitors » renferme des inhibiteurs de la chymotrypsine qui sont des peptides d’environ 6 kDa possédant cinq ponts disulfure (Bania, 1999).

Une des fonctions des IP de l’hémolymphe est probablement la régulation des protéases impliquées dans les réactions immunitaires telles que la synthèse de peptides antimicrobiens et la synthèse de mélanine :

- la réaction immunitaire en réponse aux micro-organismes est particulièrement bien étudiée chez la drosophile grâce aux outils génétiques que constituent les lignées mutantes.

Spz Toll Pelle Tube Dif Cactus Drosomycine

?

Figure 2.1 : Contrôle d’une voie de la synthèse inductible de peptides antimicrobiens chez la drosophile adulte (Imler et Hoffmann, 2001).

Le récepteur TOLL est activé par le facteur de croissance SPAETZLE (SPZ). Le récepteur TOLL induit la phosphorylation de l’inhibiteur CACTUS par l’intermédiaire des protéines TUBE et PELLE. La

dégradation de CACTUS permet le passage dans le noyau du facteur de transcription DIF (Drosal-related immune factor) qui induit la synthèse du peptide antifongique DROSOMYCINE

Pour se défendre contre les pathogènes, la drosophile met en jeu une réponse humorale et cellulaire. La réponse humorale est basée sur l’induction et la secrétion dans l’hémolymphe de nombreux peptides. Ces derniers possèdent une activité antifongique (DROSOMYCINE,

METTCHNIKOWIN) ou antibactérienne (DIPTERICINE, DROSOCINE, CECROPINE, ATTACINE,

DEFENSINE). La voie de signalisation permettant l’activation du gène codant la DROSOMYCINE

(figure 2.1) met en jeu une cascade de régulation de plusieurs effecteurs dont des protéases à sérine (Imler et Hoffman, 2001). Bien que l’on ne connaisse pas encore comment la cascade est déclenchée en amont, des antigènes présents à la surface du champignon¹⁶ pourraient être reconnus par un récepteur activant en cascade le clivage du propeptide de plusieurs protéases à sérine (codées par les gènes GASTULATION DEFENSIVE, SNAKE et EASTER). La protéase EASTER

clive le polypeptide SPAETZLE qui active alors le récepteur transmembranaire TOLL. La réaction entre ces deux protéines n’est pas encore complètement élucidée mais elle conduit à la réponse cellulaire : l’interaction entre le ligand extracellulaire SPAETZLE et le récepteur

TOLL induit la phosphorylation de l’inhibiteur CACTUS via la protéine TUBE et la kinase

PELLE¹⁷. La phosphorylation de CACTUS représente un signal pour sa dégradation et permet

ainsi le passage du facteur de transcription DROSAL du cytoplasme au noyau induisant la transcription du gène de la DROSOMYCINE.

Des inhibiteurs de protéases régulent cette voie de signalisation. Chez le mutant de drosophile déficient pour le gène spn43ac codant pour un inhibiteur de protéase à sérine, on observe une expression constitutive de la DROSOMYCINE ainsi que le clivage permanent de SPAETZLE

(Levashina, 1999). Des inhibiteurs de protéases sont donc des modulateurs de la réponse immunitaire des insectes.

- la mélanisation est un autre mode de neutralisation du pathogène. Lorsque l’organisme étranger est trop gros pour être phagocyté par les hémocytes, il est encapsulé grâce à de multiples couches de mélanine. Ces capsules de mélanine isolent, immobilisent et tuent le pathogène. L’encapsulation est généralement une réponse à la présence de protozoaires ou de métazoaires comme des parasites et des œufs de parasitoïdes (Gillespie, 1997).

16 Chez le ver à soie, les antigènes reconnus à la surface du champignon sont des β1-3 glucanes. Des protéines qui reconnaissent spécifiquement ces sucres ont été isolées de l’hémolymphe de Bombyx mori (cité dans Gillespie et Kanost, 1997) et semblent actuellement appartenir à la famille des PGRP.

Utilisation et diversification des inhibiteurs de protéases à cystéines

95 Une des enzymes clé de la mélanisation est la prophénoloxydase (PO). Cette enzyme catalyse l’oxydation de phénols en quinones qui polymérisent spontanément en mélanine. Bien que les étapes directes de reconnaissance d’antigènes tels que des lipopolysaccharides, des β1-3 glucanes ou des peptidoglucanes, ne sont pas encore connues, l’activation de la PO est médiée

via une cascade protéasique. La PO est présente dans l’hémolymphe ou dans les hémocytes

sous forme inactive (proPO), ce zymogène est clivé par une cascade de protéases à sérine en amont.

Une seule protéase a été isolée à ce jour, chez le ver à soie, c’est la protéase responsable de la dernière étape. L’enzyme activatrice de la prophénoloxidase (PPAE) est une protéase à sérine, homologue à la protéase EASTER (Satoh, 1999).

L’hémolymphe du moustique contient au moins cinq protéases à sérine dont quatre sont induites par la présence de bactéries. L’une d’entre elles présente plusieurs domaines de reconnaissance potentielle du pathogène (Gorman, 2001).

Certains inhibiteurs de protéases à sérine de l’hémolymphe pourraient réguler la mélanisation. Par exemple, Boigegrain et al. (1992) ont observé que les peptides isolés de l’hémolymphe du criquet inhibaient non seulement la chymotrypsine et l’élastase, mais aussi la cascade d’activation de la PO chez cet insecte.

Les IP à sérine ont également un rôle défensif direct. Les microorganismes produisent des enzymes protéolytiques leur facilitant la pénétration à travers la cuticule. Eguchi et al. (1993) ont observé que les IP de l’hémolymphe ou de la cuticule du ver à soie inhibaient fortement l’activité des protéases synthétisées par les champignons entomopathogènes. Un inhibiteur de protéase à sérine (Fungal Protease Inhibitor-F) hémolymphatique inhibe aussi la sporulation du champignon pathogène Beauveria bassiana (Yoshida, 1990 cité dans Eguchi, 1993). D’autre part, lorsque la larve du lépidoptère Hyphantria cunea est envahie par des bactéries, une serpine est sur-exprimée une heure après l’infection par E. coli (Shin, 1998). Ces inhibiteurs de protéases pourraient protéger l’insecte des activités protéasiques exogènes lors de l’infection par des pathogènes.

Enfin, les IP de l’hémolymphe des larves d’une espèce inhibent fortement les protéases digestives de la même espèce (Eguchi, 1993 ; Girard, 1998a). Ces IP possèderaient une fonction de protection tissulaire. Ils inhiberaient des protéases libérées dans le fluide de la mue à la suite de la destruction des tissus lors de la métamorphose ou après lésion du tube digestif par les pathogènes.

1.2.2. Les inhibiteurs de protéases à cystéine

Seuls trois inhibiteurs de protéase à cystéine ont été isolés chez les insectes. L’hémolymphe de Sarcophaga peregrina renferme deux inhibiteurs de protéases à cystéine Aα (10 kDa) et Aβ (9,5 kDa) (Suzuki, 1985). Ces deux protéines sont le résultat d’une modification post-traductionnelle du produit d’un seul gène (Saito, 1989). On retrouve ces deux IP soit sous la forme libre, soit complexée (2Aα –Aβ) dans l’hémolymphe. Il semble que le complexe présente une plus faible capacité d’inhibition des protéases présentes dans les hémocytes (majoritairement des protéases à cystéine) que les formes libres. Les conditions d’association/dissociation du complexe pourraient donc réguler l’activité de ces IP. L’expression du gène codant ces IP est activée transitoirement au stade pupe. Une fonction possible de cet inhibiteur serait de protéger les tissus de l’adulte en développement, tel que le disque imaginal, des protéases hémocytaires.

Chez la drosophile, un gène codant pour un inhibiteur de protéase à cystéine a été cloné (Delbridge, 1990), et trois autres membres de cette famille sont présents dans le génome de cette espèce. Les séquences des IP de drosophile et de Sarcophaga montrent qu’ils appartiennent à la famille des cystatines (Brown, 1997), caractérisée par la présence de motifs spécifiques de l’inhibition des protéases à cystéine (QxVxG et PW) et pour certaines d'un pont disulfure.

1.2.3. Les autres inhibiteurs de protéases

Un seul inhibiteur de métalloprotéase a été mis en évidence, chez la teigne de la ruche,

Galleria mellonella. Cet IP est inductible et présent dans l’hémolymphe de l’insecte

uniquement après immunisation contre les champignons. C’est une protéine de 8 kDa qui renferme cinq ponts disulfure. Aucune métalloprotéase n’ayant été détectée dans l’hémolymphe de Galleria, il semble donc que cet IP intervienne dans l’inhibition de protéases synthétisées par les pathogènes (Wedde, 1998).

Notre étude a pour but d’évaluer la diversité des IP de l’hémolymphe du puceron, leur capacité à inhiber les protéases digestives et d’élargir le spectre d’IP disponibles pour la transformation des plantes grâce à l’isolement d’un IP du puceron.

Utilisation et diversification des inhibiteurs de protéases à cystéines

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