Les mêmes méthodologies ont été appliquées pour l’expression de PsTI et du mutant PsCI.
2.1 Synthèse du gène artificiel
Connaissant la séquence protéique de PsTI ainsi que la séquence nucléotidique d’une isoforme de PsTI, nous avons défini 5 oligonucléotides de 50 bases correspondant au brin codant et 5 oligonucléotides identiques au brin non-codant. Chaque amorce sens est complémentaire d’une amorce antisens sur 40 paires de bases et complémentaire de la suite sur 10 nucléotides (figure 3.8).
Les 10 oligonucléotides phosphorylés (20 pmol) sont mélangés dans un volume de 100 µl final et chauffé pendant 15 minutes à 90°C. Puis la température est diminuée de 10° toutes les 15 minutes. Lorsque la température atteint 60°C, 10 unités de ligase thermostable (Epicentre) sont ajoutées au mélange. La ligation des amorces se poursuit pendant 1 heure à 60°C puis 1 heure à 50°C. La ligase catalyse la formation d’une liaison hydrogène entre l’extrémité 3’OH d’un oligonucléotide et l’extrémité 5’Phosphate de l’oligonucléotide suivant.
Le produit de la réaction est cloné dans le vecteur pBS KS- digéré par les endonucléases de restriction EcoRI et XbaI. Le respect de la séquence codante a été vérifié par séquençage du plasmide pBS-IP avec les amorces universelles (Forward et Reverse).
2.2.Expression dans la levure
2.2.1. Construction du vecteur d’expression
Le plasmide pBS-IP est digéré par les enzymes de restriction EcoRI et XbaI afin d’isoler le gène synthétique. Le gène est inséré dans le vecteur pPICZαA (Invitrogen) digéré au préalable par les mêmes enzymes. Ce vecteur est un vecteur qui permet l’expression et la sécrétion de protéines recombinantes dans la levure Pichia pastoris (figure 3.9). La protéine est exprimée sous le contrôle d’un promoteur inductible par le méthanol et en fusion avec un signal de sécrétion (le facteur α de Saccharomyces cerevisiae). La sélection des bactéries et
pPICZαααα a
Figure 3.9 : Représentation shématique du vecteur d’expression dans la levure Pichia pastoris. Le gène codant la protéine d’intérêt est sous le contrôle du promoteur AOX1 inductible par le méthanol. La protéine hétérologue est fuisionnée avec le facteur α, permettant sa secrétion dans le milieu de culture. Les levures recombinantes sont sélectionnnées grâce à leur résistance à l’antibiotique Zéocine porté par le vecteur pPICZ.Gene synthétique
Stopdes levures recombinantes s’effectue grâce à l’expression du gène de résistance à la Zéocine™26 (Invitrogen), porté par le vecteur pPICZαA.
Le vecteur d’expression pPICZ-IP ainsi obtenu, est amplifié dans E. coli puis linéarisé par digestion de l’enzyme SacI et introduit dans la souche GS115 de la levure Pichia pastoris (Invitrogen) selon le protocole recommandé par le fournisseur.
Les transformants sont sélectionnés sur milieu YPD-sorbitol (annexe 3) contenant 100 µg.ml-1 de Zéocine™ à 30°C.
2.2.2. Expression des protéines recombinantes
Dix clones de levures recombinantes sont pris en compte pour chaque construction (PsTI et PsCI). Une colonie est utilisée pour inoculer 20 ml de milieu BMGY (annexe 3) additionné de 100 µg.ml-1 de Zéocine™ dans une fiole de 250 ml. Les levures sont incubées à 30°C, sous agitation de 250 rpm, jusqu’à atteindre une densité optique à 600nm de 2 à 6 (soit environ 24 heures). Les cellules sont culottées puis reprises dans un milieu de culture BMM (annexe 3) afin d’atteindre une densité optique à 600 nm égale à 1 dans un volume final de 20 ml. L’expression de la protéine recombinante est induite grâce à l’addition de méthanol à une concentration finale de 0,5% (v/v) dans le milieu de culture.
Tous les jours, 1 ml de culture est prélevé et remplacé par le même volume de milieu BMM-15% méthanol, pendant 4 jours. Les échantillons sont centrifugés à 1500 g pendant 5 minutes. Le surnageant est dialysé contre un tampon Tris –HCl 100 mM pH 8 grâce à une membrane présentant une limite d’exclusion de 5 kDa (Millipore). Le dialysat est lyophilisé et conservé à 4°C. Au moment de l’utilisation, la poudre est pesée et reprise dans un volume d’eau désirée.
L’expression de la protéine recombinante est estimée en Dot-blot selon le protocole décrit au paragraphe 2.3.3.2. pour le niveau d’expression de l’IP dans les plantes transgéniques.
2.2.3. Vérification de l’activité biologique des IP.
L’activité inhibitrice des protéines recombinantes a été vérifiée par un test d’inhibition des protéases à sérine. Une quantité croissante de surnageant de culture de levure dialysé (0 à 30µl) est incubée avec les enzymes trypsine (100 ng) ou chymotrypsine (500 ng). Les
Etude du mode d’action et modification de PsTI
139 activités enzymatiques résiduelles sont mesurées par hydrolyse d’un substrat chromogénique spécifique à 500 µM, le αN benzoyl-L arginine p-nitroanilide (BapNA) pour la trypsine et le αN benzoyl-L tyrosine p-nitroanilide (BTpNA) pour la chymotrypsine à 37°C dans un tampon Tris-HCl 100 mM pH 8.
2.3. Expression de PsTI et PsCI in planta
2. 3.1. Construction de la cassette d’expression
La phase ouverte de lecture a été obtenue grâce à une réaction de PCR sur le plasmide pBS-IP au moyen de 2 amorces : l’oligonucléotide ATG (AAG CTT ATG GGT GAT GAT GTC AAA TC) et l’oligonucléotide STOP (GAA TTC TCA GTT GTG ACA TGC TTT ATA G), complémentaires respectivement de l’extrémité 5’ et 3’ du gène synthétique. L’utilisation de l’amorce ATG a permis l’obtention d’un site de restriction HindIII en amont de l’ATG. Le produit de PCR est cloné dans le vecteur pGEM-T(Promega) et le respect de la phase de lecture a été vérifié par séquençage du plasmide pGEM-IP avec les amorces universelles (Forward et Reverse).
Le plasmide pGEM-IP est digéré par les enzymes de restriction HindIII et PstI afin d’isoler la séquence codante de l’inhibiteur. Le gène est inséré dans le plasmide pLBR19 ( plasmide dérivé de pUC18 contenant le promoteur 35S avec une séquence d’amplification doublée du CaMV et le terminateur du CaMV) préalablement digéré par les mêmes enzymes de restriction.
La cassette d’expression (p35S2::IP::ter) est ensuite obtenue par digestion du plasmide pLBR19-IP, avec les enzymes de restriction KpnI et BglII. Cette cassette est clonée dans le vecteur binaire pCambia 2300 digéré par les enzymes KpnI et BamHI afin d’obtenir le plasmide pCambia-IP permettant l’expression constitutive in planta de l’inhibiteur (figure 3.10).
Les vecteurs binaires ainsi obtenus sont ensuite introduits dans la souche d’Agrobacterium