Materials and Methods
2.2. Recherche de nouveaux mutants Caractérisation d’une mutation affectant la séquence
codante du gène nd5
2.2.1. Isolement de deux nouveaux mutants insensibles à la roténone A ce stade du travail, nous avons caractérisé des mutations qui affectent la séquence codante des gènes nd1 (dum20,25), nd4 (dum22), nd4-nd5 (dum24) et nd6 (dum17), ainsi qu’une mutation localisée dans la région 3’ non traduite du gène nd5 (dum5). Afin de rechercher des mutants affectés dans la séquence codante des gènes nd2 ou nd5, nous avons effectué une nouvelle expérience de mutagenèse à l’acriflavine de la souche sauvage mt-. Après mutagenèse, les colonies ont été
dénombrées et le taux de survie a été estimé à 22%. Deux types de colonies ont été observés : des colonies minuscules (minutes) dépigmentées (82%), dont les cellules ont subi quelques divisions avant de mourir, et des colonies vertes visibles à l’œil nu (18%).
Quatre cents colonies vertes de taille relativement réduite ont été criblées en vue d’identifier un phénotype identique à celui des mutants du complexe I (dum17,20 ou 25) (cf. publication 1 et 2). Dix souches (PC1-10) qui en conditions mixotrophes sont insensibles à la roténone (35 µM) mais présentent une sensibilité aux inhibiteurs du complexe III (antimycine A 1 µM et myxothiazol 7,5 µM) ont été sélectionnées. Ces souches présentent en outre une croissance lente en conditions hétérotrophes. Six mois après leur isolement, les dix souches ont été sous-clonées et testées à nouveau. Seuls les sous-clones des souches PC7 et PC10 étaient homogènes et avaient conservé leur phénotype mutant (Tableau 9). Pour les huit autres souches, nous n’avons pas été en mesure d’isoler des sous-clones présentant le phénotype originel. Ceci suggère que des mutations de suppression ou de réversion pourraient avoir eu lieu ou que, plus probablement, l’état homoplasmique n’était pas encore atteint lorsque les souches avaient été isolées. Dans les deux cas, les quelques cellules sauvages
présentes dans les colonies auraient progressivement pris le pas sur les cellules mutantes en raison de leur croissance plus rapide.
En vue de confirmer le phénotype de sensibilité à la roténone des souches PC7 et PC10, la consommation d’oxygène des cellules a été mesurée à l’électrode de Clark en absence et en présence d’inhibiteur. Les souches sauvage (2) et mutante dum20 (235) ont été utilisées comme témoins (Tableau 9). L’activité respiratoire des souches 235, PC7 et PC10 est comparable et représente environ 50% de celle de la souche sauvage. L’addition de roténone (100 µM) fait par ailleurs chuter la respiration de la souche sauvage d’environ 55% alors que les souches mutantes sont beaucoup moins sensibles à l’inhibiteur. Ces résultats confirment que les souches PC7 et PC10 se comportent comme des mutants du complexe I (Cardol et al., 2002; Remacle et al., 2001a).
2.2.2. Analyse génétique et moléculaire des mutants PC7 (dum23) et PC10 (dum27)
Le mode de transmission d’un phénotype mutant permet aisément de déterminer le génome (nucléaire, mitochondriale ou chloroplastique) porteur de la mutation (Matagne et al., 1989). Les souches PC7 et PC10 (mt-) ont été croisées avec la souche sauvage mt+
(1) et le phénotype de la descendance méiotique a été analysé. Lors de chaque croisement, un descendant mt+
de phénotype similaire à celui de la souche mutante parentale a été isolé puis utilisé dans un croisement réciproque avec la souche sauvage mt- (2) (Tableau 10).
hétérotrophe - + R +AA+M - w t (2) 9,1 ± 0,3 45 ± 11 +++++ ++++ ++ + dum20 (235) 5,2 ± 1,2 87 ± 6 ++ ++ + ± PC7 4,1 ± 0,9 90 ± 5 ++ ++ + ± PC10 4,7 ± 0,5 87 ± 8 ++ ++ + ± mixotrophe
Souches consom m ation
d'oxygène % + R
croissance
Tableau 9. Tests in vivo portant sur les souches PC7 et PC10. L’activité respiratoire des cellules cultivées en milieu TAP est exprimée
en nmoles d’O2.min-1.10-7 cellules ; %+R : pourcentage de respiration résiduelle après ajout de 100 µM roténone (moyenne de 3
mesures indépendantes ± écart-type). La croissance des souches à la lumière est exprimée sur une échelle relative. Les phénotypes de croissance des colonies à l’obscurité sont traduits par + (normale) et ± (faible). AA : antimycine A 1 µM, M : myxothiazol 7,5 µM ; R : roténone 35 µM.
Résultats
Croisem ent (phénotype)
PC7 mt- (dk±) x w t mt+ (dk+) PC7 mt+ (dk±) x w t mt- (dk+) PC10 mt- (dk±) x w t mt+ (dk+) PC10 mt+ (dk±) x w t mt- (dk+) 30 dk+ Ségrégation m éiotique 19 dk± : 1 dk+ 20 dk+ 24 dk± : 6 dk+
Tableau 10. Analyse génétique des mutants PC7 et PC10.
Ségrégation du phénotype de croissance en conditions hétérotrophes.
Dans les quatre croisements, la descendance méiotique hérite majoritairement du caractère du parent mt-, ce qui démontre que chez les souches PC7 et PC10,
les mutations responsables de la croissance faible en conditions hétérotrophes sont bien d’origine mitochondriale. Nous pouvons donc conclure que les mutations des souches PC7 et PC10 affectent probablement un des cinq gènes nd mitochondriaux. Ces mutations ont été appelées dum23et dum27.
Dans le but d’identifier les gènes concernés par les mutations dum23 et dum27, nous avons entrepris de cartographier génétiquement les sites de mutation par analyse de recombinaison. On sait que lors d’un croisement, les rares zygotes végétatifs qui se divisent mitotiquement pour donner une descendance diploïde stable transmettent les génomes mitochondriaux des deux parents (Remacle et Matagne, 1993). Dans ces cellules hétéroplasmiques, les génomes mitochondriaux recombinent à haute fréquence (environ 3% par kb) pour générer différents types de molécules (Remacle et al., 1995), parentales ou recombinantes, qui ségréguent progressivement au cours des divisions successives. Dans le cas de croisements entre mutants mitochondriaux de type dk- ou dk±, la fréquence des recombinants sauvages dk+ dépendra de la distance physique séparant les deux mutations.
La sélection des colonies diploïdes peut s’effectuer en appliquant la complémentation intragénique entre allèles mutants du gène nucléaire ARG7 codant pour l’argininosuccinate lyase (Matagne, 1978). Les mutations dum23 et dum27 ont été associées à la mutation arg7-2 par croisement entre les souches dum23 mt- et dum27 mt- avec une souche arg7-2 mt+
(souche 158). Des clones arg7-2 dum23-27 mt- ont été
sélectionnés sur base de leur dépendance vis-à-vis de
l’arginine, de leur phénotype dk± à l’obscurité et de leur capacité à se croiser avec la souche sauvage mt+.
Ces nouvelles souches ont été croisées avec des souches porteuses d’une mutation nucléaire complémentaire (arg7-8) et de la mutation dum15 (souche 250), dum18 (souche 252) ou dum20 (souche 205) dont la position est connue sur le génome mitochondrial (cob, cox1, nd1) (Figure 15). Les taux de cellules diploïdes recombinantes dk+ ont été déterminés pour chacun des croisements (Tableau 11).
Croisement (phénotype)
dum23 mt-arg 7-2 (dk±) x dum15 mt+ arg 7-8 (dk-) 12,2% dum23 mt-arg 7-2 (dk±) x dum18 mt+ arg 7-8 (dk-) 5% dum23 mt-arg 7-2 (dk±) x dum20 mt+ arg 7-8 (dk±) 22,7%
dum27 mt-arg 7-2 (dk±) x dum15 mt+ arg 7-8 (dk-)
25%
dum27 mt-arg 7-2 (dk±) x dum18 mt+ arg 7-8 (dk-) 5,3% dum27 mt-arg 7-2 (dk±) x dum20 mt+ arg 7-8 (dk±) 4,8%
% de colonies diploïdes recombinantes dk+
Tableau 11. Analyse génétique des mutations dum23 et dum27.
Fréquence des colonies diploïdes recombinantes dk+ établies
après croisement entre souches mutantes dk± ou dk- (moyenne
de deux expériences indépendantes).
Sachant que le taux de recombinaison entre marqueurs mitochondriaux est d’environ 3% par kb (avec un taux maximum de 20-25%) (Remacle et al., 1995), les résultats suggèrent que la mutation dum23 est éloignée de dum20 (nd1), proche de dum18 (cox1) et se situe entre dum15 (cob) et dum18 (cox1). Comme le montre la , elle pourrait affecter le gène nd5. Par contre, la mutation dum27 est fort éloignée de dum15 (cob) et se situe à une distance équivalente de dum18 (cox1) et dum20 (nd1). Elle pourrait donc affecter les gènes nd2 ou nd6 (Figure 15).
Figure 15
En vue de définir les mutations dum23 et dum27 au niveau moléculaire, nous avons amplifié par PCR les régions identifiées par l’analyse de recombinaison, puis avons déterminé leur séquence. Le séquençage des deux brins a été réalisé à partir de produits de PCR indépendantes, en plusieurs étapes et en utilisant des amorces internes en plus de celles utilisés pour l’amplification (cf. Matériel et Méthode).
Résultats
Figure 15. Carte génétique d’un segment du génome mitochondrial de 15,8 kb de C. reinhardtii. La position des gènes encodant les sous-unités des complexes de la chaîne respiratoire et la position des mutations dum15,18,20 sont indiquées. Les positions des mutations dum23 et dum27 sont estimées sur base des fréquences de recombinaison du Tableau 11.
Les séquences nucléotidiques 1629-3301 et 3236-5233 (numérotation du génome mitochondrial de C. reinhardtii, numéro d’accession dans GenBank U03843) comprenant respectivement les gènes nd4 (1713-3044) et nd5 (3320-4960) ont été déterminées pour le mutant dum23. La séquence du gène nd4 ne présente aucune mutation. Par contre, une délétion d’une thymine a été identifiée au niveau d’une série de quatre thymines (nucléotides 435-438, codons 145-146) de la séquence codante du gène nd5 (546 codons). Cette mutation introduit un déphasage qui transforme le codon 146 (TTT, phénylalanine) en codon L (TTA, leucine) et introduit un stop STOP (TAG) au codon 151 (Figure 16). Nous avons par ailleurs vérifié qu’aucun autre gène nd de cette souche n’était porteur d’une mutation. La souche dum23 présente donc un réel intérêt pour la suite du travail puisqu’il s’agit du premier mutant affecté uniquement dans la séquence codante du gène nd5.
144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 ACT GGT TTT ATG TGC GTA CTT GTA GCC GCT
T G F M C V L V A A