Isolement, caractérisation et impact de mutations affectant les sous-unités ND

du complexe I chez Chlamydomonas Comme il a été signalé dans l’introduction, très peu de données sont disponibles sur la fonction des sous-unités ND du complexe I encodées par le génome mitochondrial, et ce, en dépit de la connaissance de leur structure primaire. Dans la mesure où les méthodes de

mutagenèse dirigée ne sont pas au point pour ce génome, l’obtention de mutants générés par mutagenèse aléatoire est donc d’un intérêt fondamental pour l’étude du rôle des protéines ND dans l’activité et l’assemblage du complexe I. Des données fragmentaires sont disponibles grâce à la caractérisation de quelques mutants mitochondriaux du complexe I chez divers organismes. Cependant, la plupart de ces mutations sont létales à l’état homoplasmique et leur implication sur l’activité et l’assemblage de l’holoenzyme reste difficile à préciser (cf. Introduction).

L'algue verte unicellulaire Chlamydomonas reinhardtii constitue à cet égard un organisme de choix : des mutations homoplasmiques et viables ont été obtenues dès 1989 et au début des années 90 par Matagne et ses collaborateurs (Colin et al., 1995; Dorthu et al., 1992; Matagne et al., 1989).

N° d'accession AA Espèces Annotations dans les banques Sim

Procaryotes

NP_247277 159 Methanococcus jannaschii protéine liant des ferripyochélines

CAC42862 178 Streptomyces coelicolor protéine putative liant des sidérophores 88% NP_247277 159 Methanococcus maripaludis anhydrase carbonique (famille gamma Zn-dépendante) 84% NP_276700 151 Methanothermobacter

thermautotrophicus

protéine liant des ferripyochélines 79% NP_616075 181 Methanosarcina acetivorans anhydrase carbonique/acétyl transférase isoleucine 77% NP_354523 207 Agrobacterium tumefaciens protéine liant des ferripyochélines 70% NP_281424 182 Campylobacter jejuni acétyl transférase probable 69%

Plantes

BAB08816/ At5g63510

253 Arabidopsis thaliana sous-unité du complexe I ; similaire aux acétyl transférases et aux membres d'une famille de transférases bactériennes contenant des hexapeptides répétés;

67%

NP_175159/ AAK28403/ At1g47260

278 Arabidopsis thaliana sous-unité du complexe I ; similaire aux membres d'une famille de transférases bactériennes contenant des hexapeptides répétés; facteur de transcription impliqué dans l'expression de gènes nucléaires du complexe I dans les anthères

66%

AAM64929/ At3g48680

258 Arabidopsis thaliana sous-unité du complexe I ; similiaire aux protéines liant des ferripyochélines et aux membres d'une famille de transférases bactériennes contenant des hexapeptides répétés

61%

NP_569036/ At5g66510

259 Arabidopsis thaliana sous-unité du complexe I ; similaire aux acétyl transférases et aux membres d'une famille de transférases bactériennes contenant des hexapeptides répétés

57%

BAB10927 213 Arabidopsis thaliana similiaire aux protéines liant des ferripyochélines 61% AAS48197/

AAR82950

312 Chlamydomonas reinhardtii sous-unité du complexe I ; anhydrase carbonique gamma potentielle

61% AAS48195 216 Chlamydomonas reinhardtii sous-unité du complexe I 61% AAS48196 280 Chlamydomonas reinhardtii sous-unité du complexe I 58%

Tableau 15. Exemples de séquences présentant des similarités avec à la protéine de Méthanococcus jannaschii liant des

Discussion

Il s’agit de mutations affectant les gènes cob et cox1, codant respectivement pour l’apocytochrome b du complexe III et la sous-unité 1 du complexe IV. Par la suite, le même groupe a obtenu le premier double mutant viable affecté au niveau des complexes I et III. Il s’agit de la mutation dum24, correspondant à la délétion des gènes cob, nd4 et de l'extrémité 3' du gène nd5 (Duby et Matagne, 1999). D’autres doubles mutants ont ensuite isolés, en particulier la souche dum22 dont la délétion couvre le gène cob, et l'extrémité 3' du gène nd5 (Duby, 2002; Remacle et al., 2001b). En 1998-1999, des recherches ont été entreprises par le Dr C. Remacle pour obtenir spécifiquement des mutants mitochondriaux du complexe I chez Chlamydomonas. C’est dans ce contexte qu’a débuté ce travail. Brièvement, après mutagenèse de la souche sauvage à l’aide d’ acriflavine, intercalant de l’ADN agissant préférentiellement sur le génome mitochondrial, des mutants qui, cultivés en conditions mixotrophes (lumière + acétate), présentent une insensibilité à la roténone (inhibiteur du complexe I) et une forte sensibilité à l’antimycine A et au myxothiazol (inhibiteurs du complexe III) ont été isolés. Ils présentent une croissance lente lorsqu’ils sont cultivés en conditions hétérotrophes (obscurité + acétate). La perte de l’activité du complexe I a été démontrée par des dosages biochimiques et par des mesures de respiration. Les mutations responsables des déficiences du complexe I ont ensuite été identifiées en associant des analyses génétiques et moléculaires. La transmission uniparentale "paternelle" du phénotype mutant a tout d’abord permis de localiser les mutations dans le génome mitochondrial. Des tests de recombinaison ont ensuite permis d’estimer la distance physique séparant les mutations de marqueurs connus localisés en diverses régions du génome mitochondrial. Les mutations ont enfin été identifiées par séquençage du (des) gène(s) désignés par l’analyse de recombinaison. Cinq mutations homoplasmiques, stables et viables, affectant exclusivement des gènes nd mitochondriaux, ont été identifiées par cette approche : la mutation dum25 correspond à la délétion de deux codons de la séquence du gène nd1 ; les mutations dum5, dum17 (isolée une seconde fois : dum27), dum20 et dum23 correspondent toutes les quatre à la délétion d'une thymine (T). Notons qu’une mutation nucléaire non identifiée (dn26) a été également isolée par cette méthode.

Il est intéressant de noter que les quatre délétions d’une thymine ont lieu dans une séquence comportant 2

à 4 T successives. Il en est de même pour deux autres mutations affectant le gène cox1 (dum18, 19), qui correspondent à la délétion ou à l'addition d'un T dans un groupe de 3 à 4 T (Colin et al., 1995). Les répétitions de thymines semblent donc constituer des "hot spots" de mutations lors d'un traitement à l'acriflavine. Ces mutations de délétion ou d’addition résultent certainement d'une erreur de réplication survenue suite à une distorsion de la double hélice d'ADN lorsque le colorant est intercalé.

Les mutations dum17, dum20 et dum23 induisent un changement de la phase de lecture respectivement dans les séquences codantes des gènes nd6, nd1 et nd5. Par contre, la mutation dum5 affecte la région 3’ non traduite du gène nd5. Chez Chlamydomonas, la transcription du génome mitochondrial s’effectue très certainement à partir d’une origine de transcription unique, bidirectionnelle, située entre les extrémités 5’

des gènes nd5 et cox1 ( ) et les ARNs

messagers matures sont générés par clivage des deux longs précurseurs (Boer et Gray, 1991; Duby et al., 2001; Vahrenholz et al., 1985). L’analyse des ARNs mitochondriaux a montré que la mutation dum5 affecte la stabilité de l'ARN mature du gène nd5, sans affecter la maturation des transcrits nd4 et cob. Chez Chlamydomonas, les ARNs messagers chloroplastiques possèdent souvent une séquence répétée inversée dans la région 3' non traduite, séquence qui peut potentiellement donner lieu à la formation de structures secondaires en épingle à cheveux. La suppression de cette région répétée du gène psaB entraîne une instabilité de l'ARN messager correspondant (Lee et al., 1996). L'analyse in silico des structures secondaires possibles de l'extrémité 3' non traduite du transcrit nd5 suggère également que la délétion d'une seule paire de bases est suffisante pour entraîner la formation de structures secondaires différentes (données non montrées). Différentes approches ont permis de conclure que le mutant dum5 assemble un complexe I actif, sensible à la roténone mais dont l'activité ne dépasse pas 12% de l'activité de la souche sauvage. Cette observation est à mettre en relation avec la faible quantité de transcrits nd5 chez le mutant dum5. Notons que chez une lignée de cellules humaines mutantes, l'absence de la sous-unité ND5 réduit la quantité des sous-unités encodées par le génome mitochondrial (Hofhaus et Attardi, 1995), peut-être en raison d’un défaut d’assemblage.

Discussion

Tous les autres mutants, y compris les deux mutants de délétion dum22 et dum24 préalablement caractérisés et le mutant nucléaire dn26, conduisent à l'inactivation du complexe I. Les mutants dum22 et dum24 perdent de surcroît l'activité ubiquinone:cytochrome c oxydoréductase. On peut donc conclure que la perte des sous-unités ND1, ND4, ND5 ou ND6 conduit à l’inactivation du complexe I.

Comme signalé ci-dessus, les gènes codant pour les sous-unités Nd3, Nd4L, Nd7 et Nd9 sont localisés dans le génome nucléaire. Au cours de ce travail, l’expression des gènes ND4L et ND9 a été inactivée par la technique d’interférence ARN (RNAi). Il est désormais établi qu’un ARN double-brin (ARNds) peut induire la dégradation spécifique des ARNs homologues chez les eucaryotes. Il s’agit d’un mécanisme d’inactivation post-transcriptionnel de l’expression d’un gène (Cerutti, 2003). Brièvement, l’ARNds est dégradé en segments de 21-23 nucléotides qui sont incorporés dans un complexe multiprotéique (RISC pour RNA- induced silencing complex). Les petits ARN simple-brin servent de guides au complexe RISC pour identifier l’ARN endogène complémentaire qui serait ensuite clivé par une endoribonucléase. Bien que les données

qui permettent de proposer ce mécanisme aient été essentiellement obtenues chez l’homme et la drosophile, des études génétiques laissent penser que les bases du mécanisme RNAi sont identiques chez tous les eucaryotes (Cerutti, 2003).

Suite à la transformation du génome nucléaire de la souche sauvage de Chlamydomonas avec des constructions exprimant une fusion entre deux séquences complémentaires (des gènes ND4L ou ND9), l’une en orientation sens, l’autre en orientation anti-sens par rapport aux séquences promotrices, nous avons obtenu pour chacune des transformations deux clones dont l’activité du complexe I est presque nulle (coND9- 54, -115 ; coND4L-89, -97). Les transcrits du gène ND9 sont indétectables par Northern blot réalisés à partir des ARNs totaux des souches coND9-54 et -115 alors que le niveau des transcrits ND4L est fortement réduit dans les souches coND4L-89 et -97.

Les données principales concernant les mutants du complexe I étudiés au cours de ce travail sont reprises dans le Tableau 16.

Souche Nature de la mutation

activité du complexe I (% sauvage) assemblage du complexe I et du sous-complexe (%) sauvage 100 950 kDa (100) Mutants mitochondriaux

dum5 -1T (au sein d'un groupe de 3T) dans le région 3' non traduite du

gène nd5 (réduction importante de la quantité des transcrits nd5) ~12 950 kDa (15)

dum17/27 -1T (au sein d'un groupe de 4T) aux codons 143-144 du gène nd6 0 950 kDa (1-2)

dum20 -1T (au sein d'un groupe de 2T) au codon 243 du gène nd1 0 950 kDa (1-2)

dum22 délétion du gène cob et de l'extrémité 3' du gène nd4 0 700 kDa (15)

dum23 -1T (au sein d'un groupe de 4T) aux codons 145-146 du gène nd5 0 700 kDa (15)

dum24 délétion des gènes cob, nd4 et de l'extrémité 3' du gène nd5 0 700 kDa (15)

dum25 délétion des codons 199-200 du gène nd1 0 950 kDa (100)

Mutants nucléaires

dn26 mutation inconnue 0 700 kDa (15)

coNd4L-97 0-2 950 kDa (0-2)

coNd4L-89 5 950 kDa (0-2)

coNd9-54 0-2 950 kDa (0-2)

coNd9-115 0-2 950 kDa (0-2)

Inactivation de l'expression du gène Nd9 (absence de transcrits

Nd9)

Inactivation de l'expression du gène Nd4L (réduction importante de la quantité des transcrits Nd4L )

Discussion

4.3. Rôle des sous-unités ND dans