Analyse de mutants du complexe I de C reinhardtii : étude du rôle des sous-unités ND dans l’activité et l’assemblage

du complexe I

Les sous-unités du complexe I ont une origine génétique double: la majorité d'entres elles sont encodées par le génome nucléaire tandis qu’un nombre restreint et variable de polypeptides sont encodés par les gènes nd du génome mitochondrial. Alors que le génome mitochondrial des animaux et des champignons encode sept protéines (ND1 à 6, ND4L), le génome mitochondrial des plantes supérieures en encodent deux de plus (ND7 et ND9). C’est chez le protozoaire Reclinomonas americana que l’on rencontre le plus grand nombre de gènes nd mitochondriaux (12 gènes). A l’inverse, plusieurs espèces du genre Chlamydomonas possèdent un génome mitochondrial de taille réduite, encodant seulement cinq sous-unités du complexe I (ND1, 2, 4, 5 et 6) (Nedelcu et Lee, 1998).

Le rôle de la majorité des sous-unités ND du complexe I est encore inconnu à ce jour. Cependant, comme il est actuellement possible d’inactiver l’expression de gènes nucléaires par interférence ARN ou par mutagenèse dirigée, on peut envisager d’appréhender dans un avenir proche la fonction des sous-unités encodées dans le noyau. Par contre, l’absence de techniques comparables pour le génome mitochondrial limite fortement l’étude de la fonction des sous-unités qui y sont encodées. Pourtant, l’intérêt porté à ces protéines hydrophobes va grandissant, notamment parce que des mutations affectant des gènes nd ont été associées à diverses myopathies et maladies neurodégénératives (maladie de Parkinson, neuropathie optique héréditaire de Leber, dystonie) (cf. introduction). Chez Chlamydomonas, les douze gènes nd ont été identifiés : les gènes nd1,2,4,5 et 6 sont présents dans le génome mitochondrial tandis que les gènes ND3,4L,7-11 ont été identifiés dans le génome nucléaire (cf. chapitre I). Chlamydomonas est un organisme de choix pour étudier le rôle des sous-unités ND dans l’activité et l’assemblage du complexe I. En effet, des mutations mitochondriales homoplasmiques stables et viables peuvent être obtenues par traitement mutagène à

l’acriflavine ou au bromure d’éthidium (Matagne et al., 1989). Par ailleurs, la technique d’interférence ARN s’est récemment révélée applicable pour inactiver l’expression de gènes nucléaires (Fuhrmann et al., 2001).

2.1. Mutations affectant les séquences codantes des gènes mitochondriaux

nd1, nd4, nd4+nd5 et nd6, et

l’extrémité 3’ non codante du gène nd5. Dans cette partie du travail, cinq mutants isolés après un traitement mutagène à l’acriflavine et présentant une croissance lente en conditions hétérotrophes (phénotype dk±_{) ont été caractérisés. In}

vivo, ces mutants sont insensibles à la roténone, inhibiteur du complexe I. Des analyses génétiques ont montré que quatre mutations (dum5, dum17, dum20 et dum25) affectent le génome mitochondrial alors que la cinquième est d’origine nucléaire (dn26). Ces mutations entraînent la perte de l’activité du complexe I (dum17, dum20, dum25 et dn26) ou une forte réduction de celle- ci (~88%, dum5) (Tableau 8). Des analyses de recombinaison ont permis de conclure que dum20 et dum25 sont étroitement liées et affectent probablement la séquence du gène nd1, que dum5 est située dans la région comprenant les gènes nd4 et nd5, et que dum17 est localisée dans le gène nd2 ou nd6. L’analyse de ces séquences chez les quatre mutants a confirmé ces conclusions : dum20 est une délétion d’une thymine au codon 243 du gène nd1; dum25 correspond à la délétion de 6 pb qui élimine deux acides aminés conservés de la protéine ND1 (résidus 199-200); dum17 entraîne la perte d’une thymine au codon 143 du gène nd6 ; enfin, dum5 est également une délétion d’une thymine, 75 pb en aval du codon Stop du gène nd5. Chez ce dernier mutant, la quantité de transcrits du gène nd5 est fortement réduite. Par ailleurs l’analyse in silico de l’extrémité 3’ du gène nd5 suggère que les structures secondaires du transcrit correspondant pourraient être altérées chez le mutant dum5.

Résultats

L’impact des quatre mutations mitochondriales sur l’assemblage du complexe I a ensuite été évalué. Les mutants dum22 et dum24 préalablement isolés ont également été inclus dans cette analyse. Il s’agit de deux mutants phototrophes obligatoires (phénotype dk-_{) dont} la respiration sensible à la roténone et au cyanure (inhibiteur du complexe IV) est altérée. Leur génome mitochondrial est affecté par une délétion couvrant le gène cob et l’extrémité 3’ du gène nd4 (dum22), et les gènes cob, nd4 et l’extrémité 3’ du gène nd5 (dum24) (Duby, 2002; Duby et Matagne, 1999).

Après séparation des complexes protéiques mitochondriaux par BN-PAGE ou par centrifugation en gradient de saccharose, nous avons démontré d’une part que la diminution de la quantité des transcrits observée chez dum5 est corrélée à une réduction importante (~85%) de la quantité du complexe I de 950 kDa. D’autre part, la perte des résidus 199-200 de la protéine ND1 (dum25) n’empêche ni l’assemblage du complexe I, ni l’activité NADH déshydrogénase de son bras périphérique, alors qu’en l’absence de la protéine ND1 (dum20) ou de la protéine ND6 (dum17), aucun assemblage n’est détecté. Enfin la perte des sous-unités ND4 (dum22) ou ND4/ND5 (dum24) conduit à la formation, en quantité réduite (~10%), d’un sous- complexe de 700 kDa. Celui-ci possède l’activité

NADH déshydrogénase liée au bras périphérique. Les caractéristiques majeures de ces mutants affectés au niveau du complexe I sont reprises dans le Tableau 8.

Ces résultats ont fait l’objet des publications 2 et 3 présentées ci-après. Notre contribution à la publication 2 s’est limitée à la caractérisation biochimique des mutants.

Dans la publication 3, les masses moléculaires du complexe I et du sous-complexe présent chez les mutants dum22 et dum24 étaient estimées respectivement à 850 et 650 kDa. Ces valeurs avaient été déterminées sur base d’une droite d’étalonnage en utilisant notamment comme marqueur le complexe I de S. tuberosum dont la masse moléculaire était à l’époque estimée à 890 kDa (Rasmusson et al., 1998). Cependant, sur base des données récentes, la masse moléculaire du complexe I des plantes supérieures serait environ de 1000 kDa (Heazlewood et al., 2003). Apportant cette modification à notre courbe étalon, les masses moléculaires approximatives du complexe I et du sous- complexe sont respectivement de 950 et 700 kDa. Cette valeur de 950 kDa pour le complexe I est en bon accord avec celle calculée sur base des données obtenues dans la publication 1.

Souche Mutation

Activité du complexe I

(%)

Taille et quantité relative (%) du complexe I ou du sous-

complexe

sauvage 100 950 kDa (100)

dum5 -1T dans le région 3' non traduite du gène nd5 (faible quantité de

transcrits nd5) ~12 950 kDa (~15)

dum17 -1T dans le gène nd6 0 950 kDa (1-2)

dum20 -1T dans le gène nd1 0 950 kDa (1-2)

dum22 délétion du gène cob et de l'extrémité 3' du gène nd4 0 700 kDa (~10)

dum24 délétion des gènes cob, nd4 et de l'extrémité 3' du gène nd5 0 700 kDa (~10)

dum25 délétion des codons 199-200 du gène nd1 0 950 kDa (100)

dn26 mutation nucléaire 0 n.d.

Résultats

Publication 2. Remacle C., Baurain D., Cardol P., Matagne RF. (2001) Mutants

of Chlamydomonas reinhardtii deficient in mitochondrial complex I:

characterization of two mutations affecting the nd1 coding sequence.

Genetics 158(3):1051-60.

Copyright 2001 by the Genetics Society of America

Mutants of Chlamydomonas reinhardtii Deficient in Mitochondrial Complex I: