Le complexe I mitochondrial de C.

reinhardtii

Le complexe I, enzyme le plus volumineux de la chaîne respiratoire mitochondriale, n’a fait l’objet que d’un nombre limité de travaux au cours de la décennie qui a suivi son isolement à partir des mitochondries de cœur de bœuf en 1961 (Hatefi et al., 1961) ( ). Un regain d’intérêt pour cet enzyme a suivi son identification en tant que pompe à protons (Ragan et Racker, 1973), mais l’augmentation du nombre de publications date surtout de l’identification des gènes nd dans le génome mitochondrial humain (Chomyn et al., 1985) et plus encore de la découverte de pathologies humaines associées à des mutations dans ces gènes (Wallace et al., 1988) ( ). A l’heure actuelle, il apparaît que la majorité des désordres liés à une réduction de la phosphorylation oxydative mitochondriale résulte de déficiences du complexe I (Smeitink et al., 2001).

Figure 33

Figure 33

Figure 33. Nombre de publications annuelles sur le complexe I

depuis 1961 (adapté de (Matsuno-Yagi et Yagi, 2001) et des données publiées sur le site http://www.scripps.edu/mem/biochem//CI/publications.html).

Quelques avancées significatives relatives à l’étude du complexe I sont notées à titre indicatif (détails dans le texte).

A ce jour, et malgré les efforts importants de recherche, la structure et le fonctionnement du complexe I restent encore à bien des égards largement méconnus. De ce fait, cet enzyme est considéré par plusieurs auteurs comme une boîte noire au sein de la chaîne respiratoire mitochondriale (Matsuno-Yagi et Yagi, 2001).

Une compilation des données de la littérature suggère que des 45 sous-unités identifiées chez le bœuf (Hirst et al., 2003), 27 sont largement conservées chez les eucaryotes C.elegans (nématode), A. thaliana, O. sativa (plantes supérieures) et N. crassa (champignon) (cf. Introduction). Parmi ces 27 sous-unités, 14 sont les homologues des constituants de la NADH :ubiquinone oxydoréductase bactérienne.

Chez Chlamydomonas, en combinant une analyse protéomique du complexe I à une approche génomique, nous avons identifié 42 polypeptides, constituants potentiels de l’enzyme. La somme des masses moléculaires individuelles de ces protéines (970 kDa) est compatible avec la masse moléculaire du complexe I natif estimée par BN-PAGE (950 kDa, nos analyses ; 1000 kDa (van Lis et al., 2003)). Les douze sous-unités qui n’ont pas été identifiées par l’analyse protéomique ont des masses moléculaires inférieures à 14 kDa ou sont extrêmement hydrophobes. Des observations similaires ont été effectuées pour le complexe I humain en utilisant la même approche méthodologique (Devreese et al., 2002). Ces deux types de polypeptides contiennent peu de sites de clivage pour la trypsine et génère donc un nombre restreint de peptides susceptibles de donner un signal au spectromètre de masse. Par ailleurs, certaines sous- unités sont susceptibles d’être perdues durant la seconde étape d’électrophorèse (SDS-PAGE) ou d’échapper à la détection lors de la coloration au Bleu de Coomassie. En particulier, aucune des cinq sous-unités ND1,2,4,5,6 encodées par le génome mitochondrial de Chlamydomonas n’a été détectée. Rappelons à cet égard que les Chlamydomonaceae sont caractérisées par un nombre restreint de polypeptides encodés dans le génome mitochondrial (Nedelcu et Lee, 1998). En plus des cinq gènes identifiés chez Chlamydomonas, le génome mitochondrial des animaux et des champignons encode les gènes nd3 et nd4L, et deux gènes additionnels (nd7 et nd9) sont présents dans le génome mitochondrial des plantes supérieures. Plusieurs autres gènes, classiquement encodés dans le génome mitochondrial ont été identifiés dans le noyau chez Chlamydomonas ; c’est le cas des gènes cox2, cox3, atp6 (Funes et al., 2002; Perez-Martinez et al., 2001; Perez-Martinez et al., 2000). Il a été suggéré que les protéines ND3 et ND4L, qui possèdent trois segments transmembranaires potentiels (Walker, 1992) sont trop

Discussion

hydrophobes pour être importées au travers de la double membrane mitochondriale (Race et al., 1999). Nous avons cependant identifié les gènes ND3, ND7, ND9 et ND4L dans le génome nucléaire de Chlamydomonas et, à l’exception de la protéine Nd4L, les sous-unités correspondantes ont été détectées au niveau protéique. Comparés à leurs homologues respectifs encodés dans la mitochondrie, les quatre polypeptides de Chlamydomonas possèdent une longue extension N- terminale (jusqu’à 120 résidus), qui peut correspondre à un signal d’adressage.

La comparaison des constituants du complexe I identifiés chez Chlamydomonas avec ceux des autres organismes montre que les 27 sous-unités conservées chez les mammifères, champignons et plantes supérieures, sont également conservées chez Chlamydomonas. Par ailleurs, nous avons défini quatre nouvelles familles de protéines appartenant au complexe I, portant à 31 le nombre de constituants largement conservés chez les eucaryotes. Une trente-deuxième sous-unité (B14.7) est aussi présente chez le boeuf, chez Neurospora et chez Chlamydomonas, mais n’a pas été identifiée dans les autres groupes. En plus des 14 constituants homologues aux sous-unités bactériennes, le complexe I des eucaryotes contiendrait donc 17 ou 18 composants largement conservés (cf. Tableau 2 de la Publication 1). Généralement considérées comme accessoires parce qu’elles n’ont pas de fonction connue, ces sous-unités pourraient stabiliser l’enzyme ou jouer un rôle dans sa protection contre le stress oxydant (Friedrich et Weiss, 1996). Récemment, des recherches ont été menées pour déterminer le rôle de certaines de ces protéines. Par exemple, chez Neurospora, la dislocation des gènes encodant les homologues des sous-unités bovines 39 kDa, AQDQ, PDSW, B13, B14.7, PGIV, MWFE ou encore SDAP permet de définir leur implication dans l’assemblage de l’enzyme (cf. Introduction).

A côtés des 31-32 sous-unités conservées chez les eucaryotes, il subsiste un nombre important de sous- unités qui semblent être spécifiques à chaque lignée. Cependant, dans la mesure où ces protéines sont fortement divergentes au sein de leur groupe, on ne peut pas exclure que des homologies aient échappé à nos analyses en raison de similarités ténues. Sans études plus détaillées sur le complexe I d’organismes variés, il nous paraît difficile de déterminer si ces protéines sont des orthologues faiblement conservés, des homologues structurels ou s’il s’agit réellement de composants

spécifiques à certaines lignées qui auraient été acquis ou perdus durant l’évolution des espèces. Néanmoins, 11 protéines semblent être spécifiques aux mammifères et trois d’entre elles n’ont de surcroît pas d’équivalent chez les autres animaux. Trois sous-unités sont spécifiques des champignons et au moins neuf sont typiques des eucaryotes photosynthétiques, y compris C. reinhardtii. On note aussi deux composants communs aux animaux et aux champignons (B15 et ASHI), et une sous-unité (20.9) présente chez les champignons et les plantes qui n’a pas d’équivalent chez les animaux. Sur base des connaissances actuelles, il paraît probable que ces protéines ne sont pas requises pour le transport d’électrons dans le complexe I. Dans ce contexte, l’absence de la sous-unité 21.3a identifiée chez Neurospora et qui n’a pas d’équivalent connu chez les autres organismes, entraîne une réduction de la quantité de complexe I (25% du sauvage) et l’accumulation du bras périphérique (Alves et Videira, 1994). Par ailleurs, l'interruption du gène encodant la sous-unités 20.9 chez N. crassa n'empêche pas l'assemblage du bras périphérique mais conduit tout de même à l'accumulation d'un petit sous-complexe membranaire (Schulte et Weiss, 1995). Ces observations témoignent du rôle que certaines sous-unités non conservées pourraient jouer dans l’assemblage de l’enzyme.

Avec 38 constituants en commun, les complexes I de Chlamydomonas et des plantes supérieures sont très similaires. Un trait caractéristique des eucaryotes photosynthétiques semble être la présence de protéines apparentées à des protéines bactériennes liant des ferripyochélines (sidérophores à Fer) (cf. Tableau 2de la Publication 1). Trois protéines de cette famille ont été identifiées dans la préparation de complexe I de Chlamydomonas et plusieurs ont également été détectées en association avec le complexe I chez A. thaliana, O. sativa, S. tuberosum et V. faba (Heazlewood et al., 2003). En consultant les annotations des banques de séquences, il apparaît que ces protéines présentent également de fortes similarités avec des protéines de type anhydrase carbonique ou acétyl transférase bactériennes (Tableau 15). C’est ainsi que la protéine de Chlamydomonas AAS48197 est annotée comme protéine hypothétique de type anhydrase carbonique gamma (AAR82950), mais à notre connaissance, aucune publication n’a suivi cette description. Par ailleurs, la protéine d’Arabidopsis AAK28403/At1g47260 est également proposée comme facteur de transcription impliqué dans l’expression spécifique de gènes encodant des sous-unités du

Discussion

complexe I dans les anthères. Cette annotation date de 2001 et n’a pas fait l’objet de publication ultérieure. Comme on le voit, sans données plus spécifiques, il est difficile d’attribuer un rôle à ces protéines associées au complexe I des eucaryotes photosynthétiques. Il a néanmoins été suggéré qu’elles pourraient lier des ions Fe, agissant comme des senseurs mitochondriaux ou intervenant dans le stockage des ions pour leur assemblage ultérieur au sein des centres Fe-S (Heazlewood et al., 2003).

4.2. Isolement, caractérisation et impact de