Materials and Methods
Figure 26 Crible des co-transformants coND9 et coND4L par
BN-PAGE. Les protéines d’un extrait total (100 µg par puits) des souches cultivées sur milieu TAP+NO3- ont été solubilisés
avec du n-dodécyl-β-D-maltoside à la concentration finale de 1,5% (w/v). Après électrophorèse, le gel a été incubé dans une solution de coloration au NADH/NBT.
Résultats
2.3.2.3. Régulation de l’inactivation par le promoteur inductible PNIT/TUB
Le promoteur chimérique NIT/TUB est fort peu exprimé en présence d’ammonium (Loppes et Radoux, 2002). Afin de tester si la répression de l’expression des constructions chimériques conduit à une diminution de l’activité NADH déshydrogénase du complexe I, les souches ont été cultivées sur milieux TAP+NH4+ et TAP+NO3-. Après séparation des protéines par BN- PAGE, nous n’avons observé aucune différence d’activité du complexe I (NADH/NBT) entre les deux conditions de culture (Figure 27).
En raison des effets de position, l’importance du niveau de transcription du locus RNAi dans l’inactivation post-transciptionnelle du gène cible n’est pas connue (Fagard et Vaucheret, 2000). Nos observations laissent penser que le niveau d’expression basal assuré par le promoteur minimal de la β-tubuline est suffisant pour induire le phénomène d’interférence ARN. Néanmoins, on peut aussi supposer que plusieurs événements d’intégration de la construction ont eu lieu dans les différentes souches, et qu’au moins une des constructions est exprimée de manière constitutive (délétion des éléments régulateurs, environnement transcriptionnel élevé).
Figure 27. Effet de la source d’azote sur l’activité NADH:NBT
oxydoréductase du complexe I des souches coND9-41, coND4L-97 et coND9-115. Les protéines d’un extrait total (120 µg par puits) des souches cultivées sur milieu TAP+NH4+ ou
TAP+NO3- ont été solubilisés avec du n-dodécyl-β-D-maltoside
à la concentration finale de 1,5% (w/v). Après électrophorèse, le gel a été incubé dans une solution de coloration au NADH/NBT.
2.3.3. Analyse des transcrits
Dans le but de mettre en évidence une possible dégradation spécifique des transcrits des gènes ND4L et ND9 dans les souches coND4L-89, -97 et coND9-54, -
115, les ARN ont été analysés par hybridation sur Northern blot à l’aide de sondes spécifiques aux gènes ND4 et ND9. Les sondes ADN ont été amplifiées à partir des plasmides pND4L-2 et pND9-2 puis marquée au 32P (cf. Matériel et Méthodes). Dans chaque cas, la sonde reconnaît chez la souche sauvage un transcrit unique (Figure 28). Les tailles des transcrits correspondent aux tailles des ADNc déterminés par le « Chlamydomonas Genome Project » (1,54 kb pour l’ADNc du gène ND9 et 1,62 kb pour l’ADNc du gène ND4L). Chez les deux souches coND4L, le signal correspondant aux transcrits du gène ND4L diminue considérablement (60-70 %) alors que des signaux d’intensité identique à celui du témoin sont observés avec la sonde ND9. Chez les deux mutants coND9, les niveaux des transcrits ND4L sont équivalents à ceux de la souche sauvage. Par contre, aucun signal n’est mis en évidence avec la sonde ND9.
Figure 28. Northern blot des transcrits des gènes ND4L et ND9
chez les souches sauvage (83) et mutantes coND4L, coND9. Les sondes ND4L (~600 pb) et ND9 (~500 pb) marquées au P32
ont été utilisées. Après électrophorèse des ARN totaux (15 µg), le gel a été coloré au bromure d’éthidium. Les ARNr sont montrés comme contrôle de chargement.
Résultats
La diminution drastique (ou l’extinction) de l’activité NADH:NBT oxydoréductase du complexe I des souches coN4L-89, -97 et des souches coND9-54, - 115, est donc liée à une réduction significative et spécifique des transcrits ND4L et ND9. Notons que dans une expérience sur l’inactivation post-transcriptionnelle de l’expression du gène encodant l’opsine chez Chlamydomonas, Furmann et al. ont observé une réduction du niveau des transcrits non corrélée à la diminution de la protéine correspondante (Fuhrmann et al., 2001), dans un rapport similaire à celui observé pour les souches coND4L-89 et -97.
2.3.4. Impact de l’inactivation de
l’expression des gènes sur l’activité et l’assemblage du complexe I
L’activité spécifique NADH:ferricyanure oxydoréductase d’extraits membranaires des souches mutantes coND4L-89, -97 et coND9-54, -115 a été comparée à celle de la souche sauvage (wt cw15) et des co-transformants coND4L-85 et coND9-41 dont l’activité NADH déshydrogénase n’est pas affectée (Figure 26). Chez les quatre mutants, elle oscille entre 12% (coND9-115) et 30% (co-ND4L-89) de l’activité de la souche sauvage (Tableau 14) Ces données confirment que l’activité du bras périphérique est perturbée chez les mutants.
L’activité spécifique du complexe I a été également mesurée. Chez les trois souches témoins, elle représente environ 50% de l’activité NADH:duroquinone oxydoréductase totale (~50 nmoles de NADH oxydés. min-1.mg-1 protéines). Par contre, elle est très faible (1,8-4,2% du sauvage) dans le cas des mutants coND4L-97, coND9-54 et coND9-115, et inférieure à dix pourcents de l’activité sauvage chez le mutant coND4L-89 (Tableau 14). Ces données
indiquent que la perte de l’activité du complexe I est corrélée à l’extinction de l’expression du gène ND4L ou du gène ND9.
Enfin, l’activité cytochrome c oxydase a été mesurée. Aucune différence significative n’est observée entre les souches sauvages et mutantes.
L’assemblage du complexe I des co- transformants coND9-54 et-115, coND4L-89 et -97 a été analysé par BN-PAGE à partir d’extraits protéiques membranaires. Les souches sauvage (souche 2) et dum17 (souche 233) ainsi que les co-transformants coND9-41 et coND4L-85 (qui ne sont pas affectés) ont été utilisés comme témoins. Que ce soit après mise en évidence par réaction de coloration enzymatique (NADH/NBT) (données non montrées), par coloration des protéines au Bleu de Coomassie (Figure 29) ou par détection immunologique sur Western blot avec un anticorps polyclonal dirigé contre le complexe I de Neurospora (données non montrées), nous observons pour les quatre souches mutantes une diminution de plus 95-98 % du signal à 950 kDa. Aucune autre différence entre les profils des protéines colorées au Bleu de Coomassie des souches sauvages ou mutantes n’a été détectée. Ces résultats ont été confirmés par des analyses sur des extraits mitochondriaux (données non montrées). Dans ce cas, le sous-complexe de 200 kDa à activité NADH déshydrogénase a été observé chez toutes les souches.
De l’ensemble de ces observations, il apparaît donc que l’inactivation de l’expression des gènes ND9 et ND4L empêche l’assemblage du complexe I.
coND4L coND9
wt 85 89 97 41 54 115
(témoin) (témoin)
NADH:ferricyanure 2489 ± 614 2235 ± 198 739 ± 208 401 ± 219 2023 ± 256 401 ± 113 289 ± 57 NADH:DQ totale 108 ± 21 98 ± 15 49 ± 11 37 ± 8 112 ± 26 50 ± 12 45 ± 8 NADH:DQ sensible à la roténone (CI) 50 ± 22 46 ± 15 4,2 ± 1,8 0,9 ± 0,7 56 ± 13 2,1 ± 1,5 1,2 ± 1,1
cytochrome c oxydase (CIV) 245 ± 29 212 ± 23 245 ± 12 229 ± 41 245 ± 26 263 ± 23 202 ± 24
Tableau 14. Activités spécifiques NADH :ferricyanure oxydoréductase (nmoles de Fe(CN)6-3 réduit.min-1.mg prot-1),
NADH :duroquinone oxydoréductase (nmoles NADH oxydés.min-1.mg-1 prot-1) totale et sensible à la roténone (complexe I), et
Résultats
Figure 29. Coloration des protéines au Bleu de Coomassie
après BN-PAGE d’extraits protéiques membranaires totaux (120 µg) solubilisés au n-dodécyl-β-D-maltoside (2% final [w/w]).
Résultats