II- Validations fonctionnelles : rôle des partenaires nucléaires d’HBc dans
II.1. Speckles, Paraspeckles et infection par HBV
II.1.2. Rôle des protéines des Speckles et Parapseckles dans l’établissement
Afin de poursuivre l’étude du rôle des protéines des Speckles et Paraspeckles dans l’infection par HBV, nous avons voulu déterminer l’effet de l’inhibition de certaines de ces protéines sur l’établissement et la persistance d’HBV dans les hépatocytes. Cette analyse préliminaire s’est d’abord focalisée sur quelques représentant types de ces deux corps nucléaires, en particulier SRSF1, RBM14 et NONO, indépendamment de leurs niveaux de représentation dans le protéome d’HBc.
La protéine SRSF1 qui est considérée comme le prototype de la famille des protéines SR. Ainsi, malgré sa faible détection dans les complexes associés à ST-HBc après purification en présence de benzonase (Figure 29A et 30A), nous avons poursuivi les investigations sur cette protéine. L’effet de l’inhibition de SRSF1 par siRNA a été répété en dHepaRG, et testé en PHH, selon le protocole décrit dans la figure 35.
117 Figure 35. Protocole de transfection des siRNA avant l'infection.
Les siRNA ont été transfectés dans des cellules dHepaRG (A) ou PHH (B) qui ont été ensuite été infectées avec HBV pendant 16h. Les paramètres viraux ont été mesurés 7 jours après infection.
Un Western blot réalisé sur les extraits protéiques des cellules dHepaRG, récoltés à J0 et J7 post-infection (pi), nous a permis de confirmer l’efficacité de l’invalidation de SRSF1 par les siRNA (Figure R36A). De même l’analyse des extraits de PHH juste avant l’infection (J0) a montré que l’expression de SRSF1 est aussi efficacement inhibée. De plus, nous avons montré que la transfection par les siRNA n’induit pas de toxicité en comparaison des cellules non traitées, comme l’indiquent les tests au rouge neutre (RN) et à la sulforhodamine B (SRB) évaluant, respectivement, la viabilité et la densité cellulaire (Figure 36B).
L’analyse des paramètres viraux indique que l’invalidation de SRSF1 dans les dHepaRG résulte en une légère diminution du niveau en ARNpg (Figure 36C). Les niveaux en antigènes HBe et HBs, sécrétés dans le surnageant ne subissent en revanche pas de variations significatives suite à l’invalidation de SRSF1 (Figure 36D). Dans des PHH, l’absence de SRSF1 induit une diminution des ARN d’HBV d’environ 50% (Figure 36E), des antigènes viraux de 50 à 70% et des virions secrétés de 50% en comparaison aux conditions CTL (Figure 36F). Malgré de fortes variations entre les triplicats biologiques d’une même condition, ces résultats suggèrent une activité provirale de SRSF1 qu’il faudra confirmer en répétant les expériences en PHH.
118 Figure 36. Effet de l’inhibition de SRSF1 sur l’établissement et la persistance d’HBV.
Des cellules dHepaRG (A,B,C,D) ou PHH (A,E,F) ont été transfectées par des siRNA ciblant SRSF1 ou des siRNA contrôles (CTL) puis infectées par HBV à une MOI de 250 ou de 100 vge/cellule, respectivement. (A) L’efficacité d’invalidation de SRSF1 a été évaluée par Western blot à J0pi et à J7pi sur les extrait cellulaires totaux. (B) La toxicité a été évaluée dans les cellules dHepaRG par RN et SRB à J7pi. Les ARN d’HBV ont été quantifiés par RT-qPCR à J7pi dans les extraits cellulaires totaux de dHepaRG (C) et PHH (E). Les antigènes HBs et HBe sécrétés dans le surnageant ont été quantifiés par ELISA à J7pi dans les dHepaRG (D) ou les PHH (F). (F) Le niveau en virions HBV secrétés a été évalué en quantifiant les ADN HBV par qPCR dans le surnageant. n représente le nombre d’expériences indépendantes réalisées en triplicat.
119 En parallèle, pour préciser le rôle des facteurs composants les Paraspeckles, nous avons étudié plus précisément l’effet de l’invalidation de FUS, RBM14 et NONO sur l’établissement et la persistance d’HBV, grâce au même protocole. L’efficacité des siRNA contre ces trois facteurs a été évaluée par Western blot (Figure 37A). Que ce soit au moment de l’infection ou de la récolte, l’expression de ces 3 protéines est efficacement inhibée. Lors de l’invalidation de FUS, on n’observe pas de variations significatives des paramètres viraux intracellulaires ou extracellulaires (Figure 37B et C). Dans le cas de RBM14, l’ADNccc et les antigènes HBs et HBe subissent une légère augmentation (Figure 37B et C). Enfin, l’invalidation de NONO résulte en une diminution de la réplication virale visible au niveau intracellulaire (ARN et ADNccc) et extra-cellulaire (HBs et HBe) (Figure 37D et E). Le niveau en ADN viral extracellulaire ne semble en revanche pas affecté ce qui paraît contradictoire par rapport à la diminution observée en ARNpg. Ces résultats préliminaires suggèrent que parmi les 3 facteurs testés, seule la déplétion en NONO pourrait affecter la réplication virale. Cet effet se situe vraisemblablement au niveau la formation de l’ADNccc. Des expériences ultérieures devront être réalisées dans des cellules dHepaRG et PHH pour confirmer ces observations.
Dans l’ensemble, ces analyses préliminaires de l’impact de certaines protéines des Speckles et Paraspeckles sur la réplication d’HBV suggèrent que seulement certaines d’entre elles pourraient moduler le cycle viral : c’est en particulier le cas de SRSF1, composant majeur des Speckles, et de NONO, facteur constitutif des Paraspeckles. Ces deux facteurs pourraient avoir une action provirale puisque leur déplétion diminue la réplication du virus. Ces analyses demandent cependant à être confirmées en particulier dans des modèles de cellules PHH infectées. Quant aux analyses par IF, elles suggèrent qu’au moins une portion de l’HBc nucléaire se trouve à proximité voire colocalise avec les Speckles. Il faut noter que les Speckles et Paraspeckles constituent surtout des sites de stockage de ces protéines qui exercent des fonctions multiples en dehors de ces corps nucléaires. Il est donc possible qu’HBc recrute ces facteurs pour leurs fonctions en dehors de leur lieu de stockage.
120 Figure 37. Effet de l’inhibition de FUS, RBM14 et NONO sur l’établissement et la persistance d’HBV.
Des cellules dHepaRG ont été transfectées par des siRNA ciblant FUS, RBM14, NONO, ou siRNA contrôle (CTL) puis infectées par HBV à une MOI de 250 vge/cellule. Les cellules ont été récoltées 7 jours après infection. (A) L’efficacité d’extinction de FUS, RBM14 et NONO a été évaluée par Western blot, à J0pi et à J7pi sur les extraits cellulaires totaux. Les paramètres intracellulaires (B et D) ont été quantifiés à J7pi par (RT)-qPCR dans les extraits cellulaires totaux. Les antigènes HBe et HBs (C,E) ont été quantifiés à J7pi par ELISA. (E) Le niveau en virions HBV secrétés a été évalué en quantifiant les ADN HBV par qPCR dans le surnageant. n représente le nombre d’expériences indépendantes réalisées en triplicat.
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