I- Analyse protéomique des partenaires nucléaires d’HBc
I.1. Identification des protéines associées à l’HBc nucléaire
Pour purifier les complexes nucléaires associés à HBc nous avons utilisé une lignée d’hépatocytes (cellules HepaRG) exprimant une protéine HBc chimérique composée d’un peptide de liaison à la streptavidine (Strep-Tag ou ST), fusionné à l’extrémité 5’ de l’ORF d’HBc (ST-HBc) (Figure 24A). En guise de contrôle, nous avons utilisé une lignée HepaRG exprimant la protéine HBc sauvage (wt-HBc) (Figure 24A). Le deux cassettes ST-HBc ou wt-HBc ont été placées sous le contrôle du même promoteur inductible à la tétracycline (Tet).
L’expression et la localisation du ST-HBc produit par la lignée HepaRG-ST-HBc a été contrôlé par Western et blot immunoflorescence (IF) en utilisant un anticorps anti-HBc. Après induction à la Tet, la protéine ST-HBc est détectée principalement dans le noyau des cellules HepaRG-ST-HBc différenciées (Figure 24B). Comme
Figure 24. Caractérisation de la lignée HepaRG-TR-ST-HBc.
(A) Des cellules HepaRG différentiées (dHepRG) exprimant soit la protéine HBc sauvage (wt-HBc) soit la protéine HBc fusionnée à l’étiquette Strep-Tag en N terminal (ST-HBc) ont été utilisées. L’expression et la localisation de la protéine ST-HBc ont été contrôlées par IF (B) avec un anticorps anti-HBc dans les cellules dHepaRG induites à la tétracycline (+Tet) pendant 48h et par Western bot (C) L’expression de l’HBc et du ST-HBc a été contrôlée par Western blot pour chaque lignée.
100 attendu, la protéine chimérique HBc présente un poids moléculaire légèrement supérieur à l’HBc sauvage, du fait de l’ajout du ST (Figure 24C). Le ST-HBc est donc exprimé dans les cellules HepaRG et présente une localisation cohérente avec celle connue pour l’HBc sauvage, ce qui valide son utilisation pour les expériences suivantes.
Afin de purifier les complexes protéiques associés à ST-HBc, les cellules HepaRG-ST-HBc et HepaRG-wt-HBc ont été différenciées (dHepaRG) puis induites à la Tet pendant 48h. Les noyaux de chaque lignée ont été purifiés puis traités ou non par une nucléase, la benzonase, permettant d’éliminer les protéines associées au ST-HBc via des acides nucléiques. Les complexes nucléaires associés au ST-ST-HBc ont été ensuite purifiés sur des colonnes de Strep-Tactin®, un analogue de la streptavidine permettant la fixation du Strep-tag avec une haute affinité (Figure 25A). Après élution avec une solution contenant de la desthiobiotine, la qualité des complexes nucléaires purifiés et l’efficacité de purification ont été analysées sur gel d’électrophorèse SDS-PAGE coloré au nitrate d’argent et par Western blot (Figure 25B et C). Comme attendu, le profil en nitrate d’argent des complexes purifiés est très différent de celui des extraits nucléaires avant purification (Figure 25B, Elutions vs Input) et ne change pas significativement en présence de benzonase. De plus, une bande correspondant à la protéine HBc est retrouvée uniquement dans les élutions provenant des noyaux de dHepaRG-ST-HBc et pas dans les élutions « contrôle » réalisées à partir d’extraits nucléaires de cellules dHepaRG-wt-HBc (Figure 25B).
C’est en particulier dans la deuxième élution que l’enrichissement du ST-HBc est le meilleur (Figure 25B et C, E2 vs E1 et E3). Cette fraction a donc été utilisée pour l’analyse protéomique (chromatographie liquide couplée à une spectrométrie de masse en tandem ou nanoLC-MS/MS). La purification des complexes associés à ST-HBc suivie de l’analyse protéomique a été répétée trois fois sur trois lots indépendants de cellules dHepaRG.
L’identification des peptides et des protéines, les analyses statistiques et les niveaux d’enrichissement des protéines présentes dans les complexes associés à ST-HBc ont été réalisées à l’aide des logiciels MaxQuant et ProStar. Ainsi, 228 protéines totales ont été retrouvées associées à ST-HBc en l’absence de traitement par la benzonase et 270 en présence de benzonase. Le nombre plus important de protéines
101 Figure 25. Purification des complexes protéiques associés à ST-HBc.
(A) Les noyaux des cellules dHepaRG exprimant wt-HBc ou ST-HBc ont été extraits, lysés puis traités ou non par une nucléase (benzonase ou Benz.). Les protéines ST-HBc ont été purifiées à partir des fractions nucléaires par passage sur des colonnes de Strep-Tactin®. Après plusieurs lavages, les ST-HBc et protéines associées ont été élués trois fois par la desthobiotine. L’élution n°2 a été analysée par spectrométrie de masse (LC-MS/MS). La purification a été répétée trois fois avec trois lots différents de dHepaRG. L’enrichissement en ST-HBc dans chacune des trois élutions (E1, E2, E3) a été contrôlé par (B) coloration au nitrate d’argent et (C) Western blot, en comparaison avec la fraction nucléaire chargée sur la colonne (Input). Pour le Western blot, un anticorps primaire anti-HBc a été utilisé.
retrouvées en présence de benzonase s’explique par le fait que son action entraine une solubilisation des complexes protéiques associés à la chromatine, qui sont alors récupérés dans la fraction nucléaire analysée par spectrométrie de masse alors que, sans traitement, les facteurs associés à la chromatine sont éliminés lors des étapes de centrifugation réalisées après la lyse des noyaux. En appliquant des filtres rigoureux de p-value (<0,005) et de score d’enrichissement (>4), nous avons pu
102 identifier 44 et 58 protéines significativement associées à ST-HBc en absence ou présence de benzonase, respectivement. Parmi celles-ci 37 protéines sont retrouvées en commun dans les deux conditions (Figure 26A).
Figure 26. Analyse statistique et bioinformatique des partenaires de ST-HBc.
(A) Répartition des partenaires nucléaires de ST-HBc en fonction de la présence ou non de benzonase. Le nombre de partenaires significativement associés au ST-HBc a été sélectionné sur la base d’une p-value < 0,005 et d’un score d’enrichissement > 4. (B) et (C) Analyse par Gene Ontology (GO – Panther) des fonctions moléculaires des 58 et 37 protéines significativement associées à ST-HBc (B) en présence de benzonase ou (C) communes aux conditions sans et avec benzonase, respectivement.
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