I- Analyse protéomique des partenaires nucléaires d’HBc
I.3. Etudes de validation
I.3.1. Détection par Western blot des partenaires de ST-HBc dans les complexes purifiés
La présence de certains facteurs identifiés dans les complexes ST-HBc a été validée par Western blot (Figure 30). Comme attendu, les protéines SRSF10, SRSF1, RBMX, DDX17, DNAJB6 et PARP1 sont détectées dans les extraits nucléaires des lignées wt-HBc et ST-HBc en présence ou non de benzonase. Après purification, toutes ces protéines sauf SRSF1 sont détectées uniquement dans la fraction purifiée issue des cellules dHepaRG-ST-HBc. Ces résultats confirment leur présence dans les complexes associés à ST-HBc. Conformément aux résultats de spectrométrie de masse (Figure 29A), SRSF1 n’est pas détectée dans les extraits purifiés après traitement par la benzonase (Figure 30A). Cependant, l’absence de détection de cette protéine dans les complexes purifiés en l’absence de benzonase est plus surprenante. Cela pourrait être dû à sa présence dans ces extraits en très faible quantité. Des validations ultérieures réalisées sur des extraits nucléaires traités à la benzonase et
108 Figure 30. Détection par Western blot des partenaires de ST-HBc dans les extraits purifiés. (A) Les extraits nucléaires de cellules dHepaRG-ST-HBc ou wt-HBc induit à la tétracycline et traités ou non par la benzonase (benz) ont été analysés par Western blot avant (input) ou après (élution) la purification sur les colonnes de Strep-Tactin®. (B) Des extraits nucléaires de cellules dHepaRG-ST-HBc induites à la tétracycline et traités par la benzonase ont été analysés par Western blot avant ou après la purification sur des billes Strep-Tactin®. Les anticorps utilisés pour la détection d’HBc et des autres protéines cellulaires sont décrits dans la section matériel et méthodes.
109 purifiés sur des billes de streptactine ont permis de confirmer également la présence de TRA2β et SRSF2 dans les complexes associés au ST-HBc (Figure 30B).
I.3.2. Interaction entre HBc et ses partenaires nucléaires
Afin de confirmer l’interaction entre la protéine HBc et les protéines identifiées dans l’analyse protéomique, nous avons par la suite cherché à mettre en évidence ces interactions dans des modèles de cellules infectées par HBV. En particulier, nous nous sommes intéressés à l’interaction entre HBc et SRSF10 ou RBMX, qui sont respectivement la protéine SR et la hnRNP les plus représentées dans les complexes ST-HBc.
Pour cela il a été nécessaire de mettre au point l’immunoprécipitation (IP) d’HBc avec un anticorps spécifique. Pour valider cette technique nous avons d’abord utilisé des extraits totaux de cellules HepaRG-ST-HBc pour réaliser l’IP avec un anticorps anti-HBc. La détection d’HBc par Western blot a permis d’établir que ST-HBc était bien détecté dans les extraits totaux après induction à la Tet (Figure 31A). La détection du ST-HBc en l’absence de Tet témoigne d’une légère fuite du promoteur utilisé pour exprimer ST-HBc (Figure 31A). Après IP, ST-HBc est détecté uniquement en présence de l’anticorps anti-HBc, très faiblement en l’absence de Tet, et fortement en présence de l’antibiotique. Les isoformes hautes et basses de SRSF10 (38 et 20 kD respectivement) ont été détectées dans les extraits totaux avant IP et après IP, avec l’anti-HBc. Les quantités de ST-HBc immunoprécipité étant très faible en l’absence de Tet, il est normal de ne pas détecter la forme haute de SRSF10 déjà faible avant IP. En revanche, les deux formes de SRSF10 sont bien détectées en présence de Tet. De même, l’IP d’HBc a permis de détecter la présence de RBMX dans ces mêmes extraits (Figure 31B). Ces deux expériences ont permis de valider la technique d’IP et de confirmer la possibilité de co-immunoprécipiter SRSF10 et RBMX avec un anticorps anti-HBc.
Par la suite, nous avons cherché à déterminer si ces mêmes complexes peuvent être détectés dans des hépatocytes infectés par HBV. Pour cela, nous avons utilisé des extraits provenant soit de cellules HepG2-NTCP soit de PHH (hépatocytes primaires humains) infectés avec HBV. En effet, ces deux types cellulaires peuvent
110 Figure 31. Co-immunoprécipitation de SRSF10 et RBMX avec un anticorps anti-HBc.
(A) Des cellules dHepaRG ST-HBc ont été induites ou non à la Tet pendant 48h puis les extraits totaux ont été soumis à une immunoprécipitation en utilisant un anticorps anti-HBc, un IgG contrôle (CTL), ou aucun anticorps (No Ab). (B) De la même façon, l’IP a été réalisée sur les extraits nucléaires des cellules dHepaRG-ST-HBc en utilisant un anticorps anti-HBc. (C-D) Co-immunoprécipitation de SRSF10 par l’ant-HBc à partir d’extraits totaux de cellules HepG2-NTCP (C) ou d’hépatocytes primaires humaines (PHH) infectées par HBV(D). (E) Co-immunoprécipitation de RBMX par l’anti-HBc à partir des extraits nucléaires de cellules HepG2-NTCP. Les protéines éluées ont été analysées par Western blot en utilisant un anticorps primaire anti-HBc, SRSF10 ou RBMX comme indiqué.
être infectés avec une efficacité supérieure à 50% des cellules ce qui n’est pas le cas des cellules dHepaRG. Les extraits totaux provenant de cellules infectées ou contrôle ont été soumis à une IP anti-HBc puis analysés par Western blot. Dans les cellules HepG2-NTCP, HBc n’est détectable qu’après IP probablement à cause de sa faible concentration dans les extraits initiaux (Figure 31C). Les formes hautes et basses de
111 SRSF10 sont détectées dans les extrait non purifiés qu’ils soient infectés ou pas, et après IP avec l’anti-HBc uniquement dans les extraits infectés (Figure 31C). Cette expérience complétée par l’IP réalisée dans des PHH (Figure 31D) a permis de confirmer l’interaction entre SRSF10 et HBc dans un contexte infectieux. De plus, l’interaction d’HBc avec RBMX a été aussi observée à partir d’extrait nucléaires de cellules HepG2-NTCP infectées par HBV (Figure 31E).
Pour déterminer si HBc et ses deux partenaires SRSF10 et RBMX, interagissent de façon directe, un test double hybride en levure a été réalisé (service sous-traité auprès de la société Creative Biolabs). Les ADNc codant pour HBc, SRSF10 et RBMX ont été clonés dans deux vecteurs d’expression « appât » et « proie », puis transfectés dans les levures qui ont été ensuite sélectionnées sur des milieux de cultures sélectifs. Aucun résultat positif n’a été observé (Annexe 1). Cela suggère que l’interaction entre HBc et RBMX ou SRSF10 pourrait être indirecte, par l’intermédiaire d’une ou plusieurs autres facteurs. Cependant, on ne peut exclure la possibilité d’une interaction directe entre HBc et SRSF10 ou RBMX qui dépendrait de modifications post-traductionnelles de ces protéines, absentes dans ce modèle de levure.
Dans la première partie de cette étude, le protéome d’HBc a mis en évidence l’importance des protéines de liaison à l’ARN, en particulier celles impliquées dans l’épissage via le spliceosome, parmi les partenaires potentiels de la protéine de capside d’HBV. Parmi les 11 facteurs les plus fortement associés à HBc, on trouve principalement des protéines SR et hnRNP, dont SRSF10 et RBMX. L’étude de l’interaction entre HBc et SRSF10 ou RBMX a permis de valider ces interactions dans un modèle infectieux. Des validations fonctionnelles ont donc par la suite été réalisées, afin de caractériser le rôle de ces facteurs dans l’infection par HBV.
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