Rôle dans la maturation du pré-ARNr 35S au sein du processome

  93 

II.2.

Rôle dans la maturation du pré-ARNr 35S au sein du

processome

La déplétion de la protéine Rrp9/U3-55K conduit à l’accumulation des pré-ARNr 35S et 23S, ainsi qu’à la diminution des pré-ARNr 27SA2 et 20S et de l’ARNr mature 18S. Par contre, les taux du pré-ARNr 27SB et des ARNr matures 25S et 5,8S restent constants (Venema et al, 2000 ; Lukowiak et al, 2000 ; Granneman et al, 2000, 2002 ; Watkins et al, 2000, 2002). Ce phénotype est identique à celui obtenu en cas de déplétion de la majorité des composants du processome, y compris la snoRNP U3 (Hughes & Ares, 1991 ; Jansen et al, 1993; Dunbar et al, 1997 ; Lee & Baserga, 1999 ). Des mutants du snoARN U3 empêchant l’association de la protéine Rrp9p présentent le même phénotype, indiquant une implication forte de la protéine Rrp9p dans la fonction de la snoRNP U3 (Clery et al, 2007), en particulier pour les clivages précoces aux sites A0, A1 et A2 du pré-ARNr 35S. Par contre, elle n’est pas impliquée dans les étapes de maturation tardives permettant la production des ARNr 25S et 5,8S et la synthèse de la grande sous-unité ribosomique 60S.

Le rôle exact de la protéine Rrp9p/U3-55K dans la maturation du pré-ARNr 35S au sein du processome n’est cependant pas connu. Elle pourrait être impliquée dans le recrutement de la snoRNP U3 au sein du processome, afin que le snoARN U3 puisse établir les appariements nécessaires avec le pré-ARNr 35S. On peut aussi imaginer qu’elle soit impliquée dans la formation et la fonction du processome en permettant le recrutement de différents facteurs nécessaires, à l’organisation structurale du processome ou à la réalisation des clivages, ou encore à l’association de facteurs nécessaires à la stabilité des appariements formés entre le snoARN U3 et le pré-ARNr 35S.

Chez l’homme, il a été montré que des mutations dans la boîte C du motif B/C, qui abolissent l’association de la protéine U3-55K, conduisent à l’abolition du recrutement de la snoRNP U3 au sein du processome (Granneman et al, 2004). En revanche, les appariements établis entre le snoARN U3 et le pré-ARNr 35S ne semblent pas requis pour l’incorporation de la snoRNP U3 au sein du processome (Granneman et al, 2004). Ceci suggère que la protéine U3-55K, en interaction avec le motif B/C, est responsable du recrutement de la snoRNP U3 au sein du processome, et constitue une plateforme essentielle au recrutement d’autres facteurs du processome (Leary et al, 2004). Il a également été montré que le complexe

Introduction

  94 

Mpp10 n’intervenait pas dans l’association de la snoRNP U3 au sein du processome, ce qui est en accord avec le fait que le complexe Mpp10 requiert les appariements entre le snoARN U3 et le pré-ARNr 35S pour son association dans le processome et que cette association se déroulerait tardivement dans la formation du processome (Granneman et al, 2004 ; Perez-Ferandez et al, 2007, 2011 ; Marmier-Gourrier et al, 2011 ; Gerczei & Correll 2004). Par conséquent, la protéine U3-55K, en se fixant au niveau du motif B/C, permet sans doute le recrutement de la snoRNP U3 au sein du processome et ainsi la formation des appariements avec le pré-ARNr 35S, qui seraient ensuite stabilisés par le complexe Mpp10.

D’autre part, les partenaires de la protéine Rrp9/U3-55K au sein du processome ne sont pas identifiés précisément. Des analyses à grande échelle, basées majoritairement sur la purification de complexes à partir d’une protéine étiquettée, et l’emploi de la spectrométrie de masse, ont permis d’identifier des complexes de protéines où était présente la protéine Rrp9, permettant ainsi d’identifier des

partenaires potentiels (site SGD :

http://www.yeastgenome.org/locus/S000006341/interaction). La majorité des protéines identifiées correspondent aux composants du processome mais ces analyses ne permettent pas d’identifier avec précision les partenaires spécifiques de la protéine Rrp9. De plus, le caractère direct ou indirect des associations identifiées n’a pas été déterminé. Des comparaisons de banques de données d’interactions protéines/protéines (PPI) ont également été réalisées (Fig. 18) (Lim et al, 2011). A ce jour, un seul partenaire spécifique a été identifié pour la protéine Rrp9p. Il s’agit de la protéine Sgd1 (Lim et al, 2011 ; Tarassov et al, 2008). Le fait que très peu de données soient disponibles sur les partenaires de la protéine Rrp9p complique la caractérisation de sa fonction.

Il est important de noter que, par co-immunoprécipitation, la protéine Rrp9p a été retrouvée associée aux pré-ARNr 27SA2, 27SB et 7S présents au sein des particules pré-60S. (Grandi et al, 2002). De plus, en purifiant des particules pré-60S à différents stades de maturation grâce à des protéines étiquetées, la protéine Rrp9p a également été retrouvée au sein d’une particule pré-60S précoce (Nissan et al, 2002). Ces résultats suggèrent qu’une fois que la snoRNP U3 est dissociée de la particule pré-40S suite au clivage au site A2, la protéine Rrp9p pourrait rester

Introduction

  95 

associée aux intermédiaires de maturation impliqués dans la voie de synthèse de l’ARNr 25S et 5,8S et serait donc présente au sein du complexe de maturation de la pré-60S. Une autre protéine est, elle, clairement impliquée à la fois dans la maturation de la petite et de la grande sous-unité ribosomiques, la protéine Rrp5p. Elle est impliquée dans les clivages précoces aux sites A0, A1 et A2, nécessaires à la biogenèse de la petite sous-unité ribosomique 40S, et dans le clivage au site A3, nécessaire à la biogenèse de la grande sous-unité ribosomique 60S. La protéine Rrp5p est d’ailleurs retrouvée dans les mêmes particules pré-60S que la protéine Rrp9p (Nissan et al, 2002). En revanche, ces deux protéines ne sont plus retrouvées au sein des particules pré-60S tardives, suggérant leur dissociation après les étapes précoces de maturation de la particule pré-60S. On peut ainsi se demander si la protéine Rrp9p n’a pas également un rôle dans la maturation de la particule pré-60S. Néanmoins, sa déplétion ne semble pas perturber la maturation de la particule pré-60S

Objectifs

  96 

Objectifs

Comme nous venons de le voir, la biogenèse des ribosomes est un processus complexe et dynamique requérant l’intervention d’une multitude de facteurs d’assemblage et de maturation pour permettre la maturation du pré-ARNr et l’assemblage ordonné des protéines ribosomiques au niveau des pré-ARNr. Cette biogenèse débute par la transcription par l’ARNr polymérase I du pré-ARNr 35S, précurseur des ARNr 18S, 5,8S et 25S. Ce précurseur est alors soumis à une série de modifications enzymatiques et de clivages exo- et endonucléolytiques. Ces étapes de maturation dépendent d’un ensemble de snoRNP à boîtes H/ACA et C/D, la RNAse MRP, ainsi que de nombreux facteurs d’assemblage et de maturation. La formation des sous-unités ribosomiques matures 40S et 60S met en œuvre deux processus d’assemblage distincts l’un de l’autre. La formation de la petite sous-unité ribosomique 40S, contenant l’ARNr 18S, se déroule au sein du SSU-processome 90S, où ont lieu les clivages précoces aux sites A0, A1 et A2 (chez la levure). L’assemblage du SSU-processome 90S se déroule de manière séquentielle avec le recrutement successif de différents sous-complexes, formant un cœur structural, et de facteurs impliqués dans la maturation du futur ARNr 18S. La snoRNP U3, appartenant à la famille des snoRNP à boîtes C/D, est essentielle aux clivages précoces du pré-ARNr. Par rapport aux autres snoARN à boîtes C/D, elle a la particularité d’avoir une longue extension en 5’, qui s’apparie au pré-ARNr, et de posséder une boîte B/C, qui fixe la protéine Snu13p et une protéine spécifique de la snoRNP U3, la protéine Rrp9p. La protéine Rrp9p présente deux régions, un domaine N-terminal contenant des sites NLS impliqués dans sa localisation nucléaire, et un domaine C-terminal structuré en « hélix propeller », pouvant former une plateforme d’interaction avec différents partenaires. Bien que l’implication du snoARN U3 dans les clivages A0, A1 et A2, par les appariements qu’il établit avec le pré-ARNr 35S formant les hélices I, II, III, V et VI, soit assez bien caractérisé, le rôle de la protéine Rrp9 n’a pas été clairement identifié. Ainsi, l’objectif principal de mon travail de doctorat a consisté en l’étude plus approfondie de la fonction de la protéine Rrp9 de Saccharomyces cerevisiae. Plusieurs questions se posaient à nous :

- La protéine Rrp9 est-elle impliquée dans la formation de la snoRNP U3 mature?

Objectifs

  97 

- La protéine Rrp9 est-elle impliquée dans le recrutement de la snoRNP U3 au niveau de l’extrémité 5’ du pré-ARNr 35S au sein du processome ?

- La protéine Rrp9 est-elle impliquée dans l’assemblage et la fonction du processome en permettant l’association d’autres facteurs via son domaine propeller, supposé être une plateforme d’interaction protéine/protéine ? Permettrait-elle ainsi de recruter des facteurs possédant des fonctions précises, nécessaires aux clivages aux sites A0, A1 et A2, tels que des endonucléases, des ARN hélicases, la GTPase Bms1 ou encore le complexe Mpp10 ?

Afin de répondre à ces questions et de progresser dans la connaissance du mode d’action de la protéine Rrp9, nous avons tout d’abord entrepris d’identifier des résidus de la protéine Rrp9 potentiellement impliqués dans sa fonction. Pour cela, un modèle du domaine « hélix propeller » a été proposé au laboratoire par C. Charron et N. Rolland. Ce modèle a été confirmé par la résolution de la structure tridimensionnelle par radiocristallographie (Zhang et al, 2013). Des résidus de surface conservés entre Rrp9p et U3-55K, situés au sein de boucles entre les différents domaines WD40, ont alors été mutés par série de deux ou trois, générant alors une petite bibliothèque de mutants de la protéine Rrp9p (thèse de N. Rolland). Afin d’étudier directement la fonctionnalité de ces mutants, nous avons généré une souche de levure, où l’expression de la protéine Rrp9p endogène peut être réprimée. Ce qui permettait de n’exprimer que les mutants de Rrp9p. En réalisant des tests de croissance, nous avons ainsi identifié un résidu important pour la fonction de la protéine Rrp9p, le résidu R289.

Une première question qui se posait était d’identifier à quel(s) niveau(x) ce résidu intervenait dans la fonction de la protéine Rrp9p. Il s’est avéré qu’en présence de la mutation, la maturation du pré-ARNr 35S était fortement perturbée au niveau des sites de clivages A1 et A2, conduisant à l’accumulation du pré-ARNr 22S, corrélée à une diminution importante de l’ARNr 18S et donc de la petite sous-unité 40S.

Une deuxième question qui se posait était de savoir si ce défaut de maturation était du à une instabilité du mutant de la protéine Rrp9p ou bien à un défaut de d’assemblage de la snoRNP U3.

Objectifs

  98 

Une troisième question qui se posait était de déterminer où et à quelles étapes le résidu R289 intervenait dans la maturation du pré-ARNr 35S. La protéine Rrp9p étant un composant essentiel du processome, on pouvait imaginer que le résidu R289 soit impliqué dans l’association avec un ou plusieurs partenaires requis pour les clivages aux sites A1 et A2. Cependant, les partenaires de la protéine Rrp9p au sein du processome n’étaient pas identifiés clairement. Nous avons alors tout d’abord déterminé quels pourraient être les partenaires potentiels de Rrp9p au sein du processome. Une fois ces partenaires identifiés, nous avons analysé si le résidu R289 de Rrp9p était impliqué dans leur interaction avec Rrp9p. Dans la même logique, la snoRNP U3 étant impliquée dans des appariements avec le pré-ARNr 35S, le résidu R289 de Rrp9p pouvait être impliqué directement, ou indirectement, via l’association avec un facteur du processome, dans la formation ou la stabilisation de ces appariements, requis pour les clivages aux sites A0, A1 et A2. Nous avons alors déterminé s’il existait un lien fonctionnel entre ces appariements et le résidu R289.

!

!

!

3%,('&(4.!

(,!

3(,5#0(.!

!

!

Matériels & Méthodes

  99 

I. Matériel