130
al, 2013). Ceci nous a permis de confirmer que nos modèles reflétaient bien la structure 3D des deux protéines.
II. Analyse de la fonctionnalité des mutants de la protéine
Rrp9p
II.1.
Génération et validation de la souche W303::pGAL-RRP9
Afin de déterminer de manière directe si les résidus mutés avaient un rôle important pour la fonction de la protéine Rrp9p, nous avons tout d’abord dû générer une souche de levure, dans laquelle l‘expression de la protéine Rrp9p endogène était placée sous le contrôle d’un promoteur GAL10 inductible en présence de galactose. Pour cela, nous avons utilisé la souche de levure S. cerevisiae W303, que nous avons convertie en une souche S. cerevisiae W303::pGAL-RRP9. Dans cette souche, en présence de galactose, la protéine Rrp9p endogène est exprimée, permettant une croissance optimale des levures, mais en présence de glucose, la protéine Rrp9p endogène n’est plus exprimée, provoquant une abolition de la croissance, qui peut toutefois être restaurée par l’expression en trans, à partir d’un plasmide, d’une protéine Rrp9p fonctionnelle. L’expression en trans d’une protéine Rrp9p non fonctionnelle ne permettant par contre pas de restaurer la croissance, ce qui nous a permis d’identifier les résidus mutés important pour la fonction de la protéine.
La souche W303 sauvage a donc été transformée avec un fragment d’ADN obtenu par PCR, contenant le gène d’auxotrophie HIS3 suivi du promoteur GAL10, bordés par des séquences correspondant à deux segments de la région promotrice du gène
RRP9. Les séquences correspondant à la région promotrice du gène RRP9 ont été choisies afin de permettre l’intégration au génome du fragment, par recombinaison homologue, 40 pb en amont du codon d’initiation de la traduction du gène RRP9. Cette distance de 40 bp était requise puisque, sur l’autre brin, un gène potentiel (YPR136C) est chevauchant avec le gène RRP9 à partir de la position 34 en amont de l’ATG. Bien que ce gène soit probablement un pseudogène ne permettant l’expression d’aucune protéine (Fisk et al, 2006), nous limitions le risque de l’observation d’un phénotype dû à son interruption. Après transformation de la souche W303, 6 colonies ont été obtenues sur milieu solide YPG HIS-, traduisant
Résultats & Discussion
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l’insertion du gène d’auxotrophie HIS3 dans le génome. Afin de vérifier que l’insertion avait bien eu lieu à l’endroit souhaité, nous avons réalisé un génotypage par PCR sur ADN génomique (ADNg) en utilisant deux couples d’oligonucléotides s’hybridant au niveau de différentes régions de l’ADNg (Fig. 25), ce qui nous permettait de vérifier que le promoteur GAL10 était bien inséré dans la région promotrice du gène RRP9. Le couple de primers 3165/3166 permettait l’amplification de l’ORF de la protéine Rrp9p, tandis que le couple de primers 8517/3166 permettait l’amplification du promoteur GAL10 inséré et de l’ORF de la protéine Rrp9p. Le couple de primers 3165/3166 a bien permis de détecter une amplification de l’ORF de Rrp9p pour les 6 clones testés, alors qu’avec le couple de primers 8517/3166, une amplification n’était observée que pour les clones 2 et 6 (Fig. 25). Ces résultats montraient que, dans ces deux clones, le promoteur GAL10 était bien intégré en amont de l’ORF de Rrp9p. Nous avons sélectionné arbitrairement le clone 6 pour la suite des expériences. La répression de l’expression de la protéine Rrp9p endogène en présence de glucose a ensuite été vérifiée par des expériences de Western-blot (Fig. 25). En présence de galactose, nous détections bien une bande de faible intensité d’une taille légèrement supérieure à 70 kDa, correspondant à la protéine Rrp9p endogène, et nous observions bien sa disparition en présence de glucose, ce qui traduisait bien la répression de l’expression de la protéine endogène dans la souche (Fig. 25). Dans cette expérience, nous avons utilisé comme contrôle l’expression de la protéine de fusion ProteinA-Rrp9p (ProtA-Rrp9p) à partir du plasmide pG1. Ensuite, l’effet de l’absence de Rrp9p sur la croissance des levures a été étudiée (Fig. 25). Pour cela, des gouttes issues de cultures, à différentes concentrations cellulaires, ont été déposées sur milieu solide contenant soit du galactose (YPG) soit du glucose (YPD), et les boîtes de Petri ont été incubées à 30°C pendant 2 jours. En présence de galactose, nous observions une croissance uniforme pour les souches W303, W303::pGAL-RRP9 et W303::pGAL-RRP9 transformée par un plasmide vide ou exprimant la protéine de fusion ProtA-Rrp9p WT. (Fig. 25). En présence de glucose, nous observions une abolition de la croissance de la souche W303::pGAL-RRP9 non transformée ou transformée par un plasmide vide, ceci contrairement à ce qui était observé pour la souche W303 (Fig. 25). Nous en avons conclu que l’expression de la protéine Rrp9p endogène était bien abolie en présence de glucose. Ces données confirmaient le caractère essentiel de la protéine Rrp9p (Venema et al, 2000). De
Figure 25 : Validation de la souche W303::pGAL-RRP9.
A. A droite est représentée schématiquement est représentée la région génomique du gène RRP9
correspondant à la souche W303::pGAL-RRP9. Après l’évènement de recombinaison, la souche W303::pGAL-RRP9 a pu être sélectionnée par le marqueur d’auxotrophie HIS3 et le gène RRP9 était ainsi placé sous le contrôle du promoteur GAL10, entrainant le déplacement en amont du promoteur endogène du gène RRP9 et ainsi son inactivation. Une réaction de PCR a été effectuée sur de l’ADNg en utilisant deux couples d’oligonucléotides (3165/3166 et 8517/3166). Ils permettaient de vérifier la présence de l’insertion du promoteur GAL10. B. Une expérience de Western-blot a également été
réalisée à l’aide d’un anticorps spécifique dirigé contre la protéine Rrp9p, ceci afin de vérifier que l’expression de la protéine Rrp9p endogène était bien réprimée en milieu solide YPD. Comme contrôle, nous avons utilisé le plasmide pG1::PROTA sans ((-)) et avec l’ORF de Rrp9p (Rrp9p). C. La
comparaison de la croissance de la souche W303 et de la W303::pGAL-RRP9, transformée ou non par un plasmide vide ((-)) ou un plasmide exprimant la protéine Rrp9p (Rrp9), a été effectuée en milieu YPD à 3 températures (20°C, 30°C et 37°C) et à différentes concentrations cellulaires (exprimées en DO600nm/mL). YPG et YPD : milieu riche contenant respectivement du galactose ou du glucose.
Résultats & Discussion
132
plus, l’expression en trans d’une protéine ProtA-Rrp9p WT à partir d’un plasmide permettait de restaurer la croissance de la souche W303::pGAL-RRP9 (Fig. 25). Nous avions donc bien réussi à générer une souche W303::pGAL-RRP9 dans laquelle l’expression de la protéine Rrp9p endogène pouvait être modulée en présence de galactose/glucose. Ce système était en outre utilisable pour tester la fonctionnalité des mutants de Rrp9p en utilisant la protéine de fusion ProtA-Rrp9p sauvage ou mutée.
II.2.
Etude de la fonction des mutants de la protéine Rrp9p
Nous avons utilisé la souche W303::pGAL-RRP9 pour déterminer la fonction de l’ensemble des mutants de la protéine Rrp9p qui avaient été générés. Cette souche a pour cela été transformée par des plasmides permettant l’expression de ces mutants et des analyses de la croissance ont été effectuées sur milieu solide à 3 températures (20°C, 30°C et 37°C) (Fig. 26).
Nous avons toujours réalisé un contrôle de croissance des souches exprimant les mutants de Rrp9p sur milieu solide YPG, ce qui nous permettait en plus de vérifier que des quantités similaires de cellules avaient bien été déposées sur le milieu solide. Dans un premier temps, nous avons déterminé si les domaines N-terminal et/ou « hélix propeller » de la protéine Rrp9p étaient capables à eux seuls d’assurer une croissance cellulaire. En exprimant seulement le domaine « hélix propeller », la croissance était comparable à celle obtenue avec Rrp9p WT, ceci aux 3 températures testées. Ceci suggérait que le domaine « hélix propeller » est suffisant pour la fonction de la protéine Rrp9p (Fig. 26). En revanche, en exprimant seulement le domaine N-terminal de la protéine, nous n’observions qu’une légère croissance par rapport à Rrp9p WT, ce qui suggèrait que ce domaine N-terminal seul est capable d’assurer une partie de l’activité de la protéine Rrp9p. Ces expériences, que nous avons répété au moins 3 fois, mettaient en lumière l’importance du domaine « hélix propeller » pour la fonction de la protéine Rrp9p (Fig. 26). Il faut noter que, récemment, l’équipe de Ye, en exprimant seulement le domaine « hélix propeller », a
Figure 26 : Analyse de la fonctionnalité des différents mutants générés dans la protéine Rrp9p.
Afin de déterminer la fonctionnalité des différents mutants de la protéine Rrp9p qui avaient été généré, des analyses de croissance de la souche W303::pGAL exprimant ces mutants ont été réalisées sur milieu YPG et YPD à 3 températures (20°C, 30°C et 37°C) et à différentes concentrations cellulaires (exprimées en DO600nm/mL). Seul le mutant Rrp9p RK 289/290 AA s’est avéré présenter un défaut de croissance. YPG et YPD : milieu riche contenant respectivement du galactose ou du glucose.
Résultats & Discussion
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observé une croissance quasiment nulle des cellules, ce qui est contraire à nos propres résultats (Zhang et al, 2013).
Dans un deuxième temps, nous avons déterminé si les mutations de certains résidus de surface que nous avions généré, localisés au sein des boucles de surface situées entre les différents domaines WD40, entrainaient un défaut de croissance. La majorité des mutants testés avaient une croissance comparable à celle obtenue pour les plasmides exprimant Rrp9p WT, suggérant que ces résidus ne sont pas impliqués dans la fonction de la protéine Rrp9p (Fig. 26). Par contre, quand le mutant Rrp9p R289A/K290A était exprimé, un défaut de croissance important était observé aux 3 températures testées. Ce défaut était plus important à 30°C et surtout à 20°C, par rapport à 37°C (Fig. 26). La caractérisation de ce mutant et la détermination du rôle des résidus R289 et K290 dans la fonction de la protéine Rrp9p sont présentés dans un article soumis à Nucleic Acids Research, inseré dans ce chapitre à la fin de la partie III.