Plasmides

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I.2.

Plasmides

pCR®-Blunt (3,5 kpb ; Invitrogen Life Technologies) : Ce plasmide a été utilisé dans un premier temps pour sous-cloner des fragments PCR correspondant à l’ORF de la protéine Rrp9 WT, puis dans un deuxième temps réaliser des mutagenèses dirigées pour obtenir les mutants de la protéine Rrp9. Après digestion par des enzymes de restriction, ces ORF ont été clonés dans le plasmide pG1::PROTA. Le plasmide pCR®-Blunt est commercialisé sous forme linéarisée portant des extrémités franches permettant l’insertion de fragment PCR à bout francs. Il contient une origine de réplication High copy rep, des gènes de résistance à la kanamycine et à la zeocine, le gène toxique ccdB, ainsi qu’une région du gène lacZ, permettant l’expression de la β-galactosidase, sous le contôle du promoteur Plac et interrompu par la cassette de clonage en 5’.

pDONR™ 207 et pDONR™ 221 (5,6 kpb ; Invitrogen Life Technologies) : Ces plasmides ont été utilisés pour cloner par la technique Gateway® des fragments PCR correspondant aux ORF des protéines du processome, ainsi que des domaines de ces protéines. Après une première réaction de recombinaison (BP), ces ORF ont été clonés par la technique Gateway® dans divers plasmides compatibles et permettant l’expression des protéines chez la levure. Les plasmides pDONR™ 207 et pDONR™ 221 contiennent une origine de réplication High copy rep, un gène de résistance à la gentamycine, le gène toxique ccdB suivi du gène de résistance au chloramphénicol, bordés par les séquences de recombinaison attP1 et aatP2.

pG1::PROTA (7,4 kpb ; Addgene) : Ce plasmide a été utilisé pour cloner les fragments ADN provenant du pCR®-Blunt correspondant aux ORF de la protéine Rrp9 WT et mutants, digérés par les enzymes de restriction BamHI et SalI. Il permet alors l’expression chez la levure de la protéine Rrp9 WT ou mutant étiquettée ProtA afin d’étudier sa fonction par diverses techniques expérimentales. Le plasmide pG1::PROTA contient une origine de réplication High copy rep, permettant son amplification chez la bactérie, ainsi qu’une origine de réplication low copy ARS/CEN, permettant quant à elle sa réplication chez la levure. Il contient également un gène

Matériels & Méthodes

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de résistance à l’ampicilline et un gène d’auxotrophie TRP1. De plus, il contient un promoteur GPD, suivi de l’étiquette PROTA, et un terminateur PGK.

pASZ11 (9 kpb ; Stotz & Linder, 1990) : Ce plasmide a été utilisé pour l’expression du snoARN U3 WT et mutants chez la levure. Il contient une origine de réplication High copy rep et low copy ARS/CEN permettant sa réplication chez la bactérie et la levure respectivement. Il contient également un gène de résistance à l’ampicilline, un gène d’auxotrophie ADE2 et le promoteur du snoARN U3, permettant son expression.

pACT2, PGBKT7 et pAS2 (8,1 kpb, 7,3 kpb et 8,4 kpb ; Clontech) : Ces plasmides ont été utilisés pour tester les interactions entre les protéines d’intérêts par la technique de double hybride. Au laboratoire, ces plasmides ont été modifiés afin de les rendre compatible avec la technique de clonage Gateway®. Le plasmide pACT2 permet l’expression de la protéine d’intérêt fusionnée au domaine d’activation de la transcription du facteur Gal4 (Gal4-AD) au niveau de la région N-terminale, tandis que les plasmides pGBKT7 et pAS2 permettent l’expression de la protéine d’intérêt fusionnée au domaine de fixation à l’ADN du facteur Gal4 (Gal4-BD) au niveau de la région N-terminale. L’expression de ces protéines est sous le contrôle du promoteur ADH1 et du terminateur ADH1. Les plasmides pACT2 et pAS2 contiennent une origine de réplication High copy ColE1 et high copy 2µ permettant sa réplication chez la bactérie et la levure respectivement. Le plasmide PGBKT7 contient une origine de réplication High copy rep et high copy 2µ permettant sa réplication chez la bactérie et la levure respectivement. Le plasmide pACT2 contient un gène de résistance à l’ampicilline et un gène d’auxotrophie LEU2 tandis que les plasmides pGBKT7 et pAS2 contiennent un gène de résistance à la kanamycine et l’ampicilline respectivement et un gène d’auxotrophie TRP1.

pnEA-3CH et pnCS (5,8 kpb, 3,5 kpb ; Diebold, 2011) : Ces plasmides ont été utilisés pour tester les interactions entre les protéines d’intérêts par la technique de co-expression. De plus, le plasmide pnCS a été utilisé pour la production de

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protéines radiomarquées au ³⁵S dans des extraits S30 de E. coli. Ces plasmides ont été modifiés au laboratoire afin de les rendre compatibles avec la technique de clonage Gateway®. Dans ce cas, les plasmides contiennent alors le gène de résistance au chloramphénicol et le gène toxique ccdB, bordés par les séquences de recombinaison attR1 et attR2. Le plasmide pnEA-3CH permet l’expression de protéines étiquetées 6-His au niveau de l’extrémité N-terminale, tandis que le plasmide pnCS permet l’expression de protéines non étiquetées. Ces deux plasmides contiennent une origine de réplication High copy rep, un gène lacI, un promoteur et un terminateur T7 et un site RBS (Ribosome Binding Site). Le plasmide pnEA-3CH contient un gène de résistance à l’ampicilline et contenait au départ un site de coupure à la protéase thrombine situé entre l’étiquette 6-His et l’ORF de la protéine d’intérêt, mais celui-ci a été modifié au laboratoire pour correspondre à un site de coupure à la protéase PreScission™. Le plasmide pnCS contient un gène de résistance à la spectinomycine.

pDEST™ 15 et pDEST™ 17 (7 kpb et 6,4 kpb ; Invitrogen Life Technologies) : Ces plasmides ont été utilisés pour la production et la purification des protéines d’intérêts chez E. coli. Le plasmide pDEST™ 15 permet l’expression de protéines fusionnées à l’étiquette GST alors que le plasmide pDEST™ 17 permet l’expression de protéines fusionnées avec l’étiquette 6-His. Ces plasmides sont compatibles avec le système Gateway® et contiennent ainsi le gène de résistance au chloramphénicol et le gène toxique ccdB, bordés par les séquences de recombinaison attR1 et attR2. De plus, ils contiennent une origine de réplication High copy rep, le promoteur et le terminateur T7, ainsi qu’un gène de résistance à l’ampicilline.

pTL26 (5,6 kpb) : Ce plasmide a été utilisé comme matrice ADN pour amplifier par PCR un fragment contenant le gène d’auxotrophie HIS3 suivi du promoteur GAL10, bordés de séquences complémentaires à celles en amont de l’ORF des gènes. Ce fragment est ensuite inséré par recombinaison homologue dans le génome de la levure afin de placer l’expression de la protéine Rrp9 endogène sous le contrôle du promoteur GAL10. Il contient une origine de réplication High copy rep et low copy ARS/CEN permettant sa réplication chez la bactérie et la levure respectivement. Il

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contient également un gène de résistance à l’ampicilline et un gène d’auxotrophie HIS3.