Maturation du pré-ARNr 35S

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le clivage au site B0 réalisé, les exonucléases Rat1 et Xrn1 hydrolysent le fragment 3’ libéré. 

II.3.

Maturation du pré-ARNr 35S

Le pré-ARNr 35S est le précurseur des ARNr matures 18S, 5,8S et 25S. Afin de les libérer, il subit une série de clivages endo- et exonucléolytiques, ainsi que des modifications des nucléotides. Ces différents événements ne se déroulent pas sur un ARN nu, mais sont accompagnés par l’assemblage de certaines des protéines ribosomiques et fait intervenir un grand nombre de facteurs d’assemblage protéiques et ribonucléoprotéiques, l’ensemble formant des particules pré-ribosomiques de taille imposante. Au cours de ces événements de maturation, des réorganisations structurales correspondant à différents repliements successifs des pré-ARNr, permettant l’association des protéines ribosomiques, ont lieu. Des facteurs d’assemblage et des snoRNP s’associent pour participer à la biogenèse. Les pré-ARNr isolés peuvent adopter un grand nombre de structures secondaires retrouvées dans les ARNr matures. Cependant la formation de certaines de ces structures lors de la transcription doit parfois être ralentie afin de faciliter certaines étapes de maturation du pré-ARNr ou d’assemblage des protéines. Certains facteurs d’assemblage et les snoRNP pourraient servir à stabiliser des conformations optimales pour la maturation ou l’assemblage en fonctionnant comme des chaperonnes. De plus, la maturation des pré-ARNr suit un ordre strict, suggérant que certains facteurs inhibent l’utilisation de sites de maturation jusqu’au moment approprié de la biogenèse. La fixation de ces protéines peut moduler la structure des pré-ARNr localement ou à distance, afin de créer les sites de fixation pour l’assemblage ultérieur d’autres protéines (Jagannathan & Culver, 2004 ; Ramaswamy & Woodson, 2009). Dans les sous-unités ribosomiques assemblées, la majorité des protéines ribosomiques interagissent directement avec les ARNr et pénètrent profondément via des extensions dans le cœur structural des ARNr (Armache et al, 2010a ; Ben-Shem et al, 2011 ; Rabl et al, 2012). Les protéines ribosomiques peuvent également représenter des sites d’interactions directs pour les différents facteurs d’assemblage. Il a été montré qu’en l’absence de certaines protéines ribosomiques, des défauts dans des étapes distinctes de maturation étaient observés, montrant leur importance dans la maturation des pré-ARNr (Moritz

Introduction

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et al, 1990 ; Deshmukh et al, 1993 ; Van Beekvelt et al, 2001 ; Jakovljevic et al, 2004, 2012 ; Leger-Silvestre et al, 2004 ; Ferreira-Cerca et al, 2005, 2007 ; Martin-Marcos et al, 2007 ; Rosado et al, 2007 ; Zhang et al, 2007 ; Robledo et al, 2008 ; Poll et al, 2009 ; Babiano & De La Cruz, 2010 ; Neueder et al, 2010 ; Fernandez-Pevida et al, 2012 ; Gamalinda et al, 2013 ; Ohmayer et al, 2013). Les fcteurs d’assemblage ne se lient que transitoirement et permettent la libération successive et ordonnée des différents facteurs et des snoRNP (Ulbrich et al, 2009 ; Bassler et al, 2010 ; Kressler et al, 2012).

Ces différentes étapes de maturation initialement décrites comme se déroulant après la transcription du pré-ARNr 35S et le clivage par Rnt1 sont maintenant considérées comme ayant lieu de manière co-transcriptionnelle au sein de la particule 90S et des complexes formés par la suite (Udem & Warner, 1972 ; Venema & Tollervey, 1999 ; Trapman et al, 1975). En effet, les facteurs nécessaires aux différentes étapes de maturation s’associent précocement au transcrit naissant et la maturation de l’ARnr 18S est complètement indépendante de celle des ARNr 5,8S et 25S/28S, l’ensemble ne dépendant pas non plus du clivage initial de la région 3’-ETS, ni de la terminaison de la transcription (Henry et al, 1994 ; Nogi et al, 1991 ; Venema et al, 1995). L’argument le plus fort a été l’observation par microscopie électronique des boutons terminaux localisés aux extrémités 5’ des transcrits naissants, se formant durant la transcription du pré-ARNr 35S (Fig. 5) (Miller & Beatty, 1969 ; Mougey et al, 1993 ; Liang & Fournier 1997 ; Dragon et al, 2002 ; Osheim et al, 2004 ; Kos & Tollervey, 2010).

On parle de structures en arbre de Noël, ou l’ADNr représenterait le tronc de l’arbre, les nouveaux transcrits les branches et les boutons terminaux représentant les boules. Ces boutons terminaux correspondent à des complexes de maturation précoces qui s’associent à la région en 5’ du transcrit naissant, et où se déroulent les premiers évènements de clivages permettant la libération des particules pré-40S, précurseurs de la petite sous-unité ribosomique 40S. Chaque répétition d’ADNr est soumise à plusieurs cycles de transcription simultanées, qui en fonction de l’avancement de la transcription donnent naissance à des transcrits de tailles différentes, où s’assemblent alors de manière co-transcriptionnelle des complexes protéiques. Le premier macrocomplexe formé a été nommé le processome 90S. Ainsi, la maturation du pré-ARNr 35S se déroule co-transcriptionnellement, comme

Figure 5 : Formation co-transcriptionnelle des particules pré-ribosomiques chez Saccharomyces

cerevisiae (Osheim et al, 2004 ; Gallagher et al, 2004).

Observation par microscopie électronique d’un gène d’ADNr en cours de transcription. Après démarrage de la transcription, un macro-complexe appelé le SSU-processome se forme à l’extrémité 5’ des ARNr naissants et forme les boutons terminaux. Les évènements de clivages précoces sur les pré-ARNr se déroulent alors au sein du processome, jusqu’au clivage au site A2, qui permet la libération de la particule pré-40S. Les boutons terminaux correspondants au processome ne sont alors plus visualisés, puis sont remplacés progressivement par un nouveau complexe de maturation formé pour la production de la particule pré-60S.

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chez les bactéries et les archaea (Osheim 2004 ; Kos & Tollervey 2010). Cependant, une différence réside dans le fait que cette maturation peut également, en fonction des circonstances, se dérouler de manière post-transcriptionnelle. En effet, il a été montré que plus de 70% des pré-ARNr naissants subissaient des clivages précoces co-transcriptionnellement dans des conditions de croissance optimales (Osheim 2004 ; Kos & Tollervey 2010). Par contre, lorsque les conditions environnementales ne sont pas favorables (choc thermique, phase stationnaire), la maturation du pré-ARNr semble plutôt être post-transcriptionnelle (Osheim 2004 ; Kos & Tollervey 2010). Les levures semblent ainsi capables de réaliser la maturation du pré-ARNr 35S de manière co- ou post-transcriptionnelle, ce qui peut fournir un moyen de régulation supplémentaire lors de la biogenèse des ribosomes.

Les chapitres qui vont suivre décriront plus précisément les différents composants intervenant dans la maturation du pré-ARNr 35S qui permet d’aboutir à la formation de la petite sous-unité ribosomique 40S chez S. cerevisiae.  

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Chapitre 1 : Les snoRNP impliquées dans la

maturation du pré-ARNr 35S

I. Modifications des résidus des ARNr

De manière précoce au cours de sa transcription, le pré-ARNr 35S est fortement modifié dans le nucléole au niveau des séquences correspondant aux futurs ARNr matures (Klootwijk et al, 1972 ; Brand et al, 1977 ; Maden, 1990 ; Ofengand et al, 1995 ; Maden & Hugues, 1997 ; Decatur & Fournier, 2003 ; Osheim et al, 2004 ; Kos & Tollervey, 2010 ;). Les deux plus fréquentes sont les pseudouridylations et les 2’-O-méthylations (Fig. 6 et 7) (Veldman et al, 1981 ; Balakin et al, 1996 ; Kiss-Laszlo

et al, 1996 ; Ganot et al, 1997 ; Decatur & Fournier, 2002 ; Liang et al, 2009 ; Watkins & Bohnsack, 2012). Ces modifications sont respectivement catalysées par des complexes ARN/protéines, snoRNP à boîtes H/ACA et à boîtes C/D. Ces snoRNP, nommées d’après la présence de motifs conservés de leurs ARN caractérisés comme étant nucléolaires, sont constituées par le petit ARN nucléolaire associé à un ensemble constant de protéines dites cœur. Les snoRNP réalisent leurs fonctions dans le nucléole (Fig. 6 et 7) (Kiss et al, 2010 ; Watkins & Bohnsack, 2012). Leur mécanisme d’action repose sur une séquence spécifique du snoARN, qui sert de guide afin de cibler la séquence de l’ARNr à modifier. Ainsi, en utilisant les mêmes protéines cœur associées à plusieurs snoARN différents, un même type de modification peut être catalysé à différentes positions sur les ARNr (Fig. 6 et 7). Ces modifications sont plus fortement concentrées dans des régions universellement conservées des ARNr impliquées dans la fonction du ribosome (Veldman et al, 1981 ; Bakin et al, 1994). Elles sont particulièrement localisées au niveau du centre peptidyl transférase (PTC), essentiel à la fonction du ribosome, à l’interface entre les 2 sous-unités ribosomiques, (Decatur et al, 2007). De plus ces modifications de la nature chimique du nucléotide peuvent faciliter le repliement des ARN et favoriser les appariements entre les segments d’ARN, jouant ainsi un rôle également dans la conformation et la stabilisation des ARN ( Krol et al, 1981 ; Branlant et al, 1981 ; Kowalak et al, 1995 ; Green & Noller, 1996 ; Nissen et al, 2000). 

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Aucun mécanisme de régulation de l’activité des snoRNP ou de détection de la présence des modifications n’a été mis en évidence à ce jour. De plus, la délétion individuelle de la plupart des snoARN, qui sont seulement responsables de modification (nous verrons ultérieurement l’importance de ceux impliqués dans les clivages), n’ont pas d’effets notables sur la croissance, la biogenèse, la stabilité ou la fonction des ribosomes (Parker et al, 1988 ; Qu et al, 1999 ; Tollervey & Kiss, 1997). Par ailleurs, il peut arriver que des sites ne soient que partiellement modifiés au niveau des ARNr. Par exemple, seulement 68% de l’ARNr 18S est méthylé à la position A100 par la snoRNP snR51 (Buhhaupt et al, 2014). Néanmoins, l’importance de certaines des modifications est reflétée par le fait que la déplétion multiple de snoARN, en particulier ceux ciblant la région de décodage ou le PTC, conduit à une croissance ralentie voir abolie, un ralentissement de l’incorporation des acides aminés, une diminution de la fidélité et de l’efficacité de la traduction ou encore à une altération de la structure même des ARNr (King et al, 2003 ; Liang et al, 2007, 2009 ; Baxter-Roshek et al, 2007 ; Jack et al, 2011). La déplétion des protéines cœur associées aux snoARN provoque également une abolition de la croissance et des défauts dans la biogenèse des ribosomes mais il faut noter que ces protéines sont nécessaires pour former les snoRNP impliquées dans les étapes de clivages (Schimmang et al, 1989 ; Tollervey et al, 1991, 1993 ; Gautier 1997 ; Lafontaine & Tollervey,1999 ; Charrette & Gray, 2000). A noter aussi que l’absence de méthylation au niveau de certains sites peut entrainer l’inhibition d’autres évènements de modification, révélant une certaine interdépendance des différentes modifications (Birkedal et al, 2014). Ainsi, au moins certaines de ces méthylations et pseudouridylations sont importantes et essentielles pour le fonctionnement optimal du ribosome, et le fait que certaines n’aient pas toujours lieu à 100% dans les ARNr matures est aussi en accord avec la notion d’hétérogénéité des ribosomes et de « ribosomes spécialisés » énoncées précédemment. Comme nous le décrirons plus loin, certaines des snoRNP, aussi bien à boîtes C/D qu’à boîtes H/ACA, possèdent en plus un rôle essentiel dans les étapes de clivage.

De façon interessante, surtout chez les vertébrés, la biosynthèse des snoRNP est coordonnée avec celle des composants de la machinerie traductionnelle (Bachellerie

et al, 2000). En effet, certains gènes des snoARN sont localisés dans des introns des ARNm permettant l’expression de protéines ribosomiques, tandis que d’autres

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snoARN mono- ou polycistroniques sont transcrits à partir de régions promotrices contenant des sites de fixation de la protéine Rap1, connue pour contrôler l’activité transcriptionnelle des pré-ARNm codant les protéines ribosomiques de levure (Qu et

al, 1999). De plus, la maturation des ARNr et des snoARN, qui sont aussi produits sous forme de précurseurs, font intervenir les mêmes enzymes de maturation (Rat1, Rnt1, Xrn1), des systèmes de co-régulation sont donc vraisemblablement mis en place afin d’assurer la coordination de la synthèse et de la maturation des différentes ARN, permettant d’assurer la biogenèse du ribosome. 

I.1.

Les snoRNP à boîtes H/ACA guidant les