A.   Le domaine 3’, contenant des motifs de type C/D

  22 

que les deux gènes de snoARN U3 de la levure S. cerevisiae et de quelques autres levures ont la particularité d’avoir un intron, éliminé par le spliceosome (Myslinski et

al, 1990 ; Brulé et al, 1995 ; Mougin et al, 1996 ; Fournier et al, 1998)  

III.1.A.

Le domaine 3’, contenant des motifs de type C/D

 Le domaine 3’ du snoARN U3 de S.cerevisiae est très structuré (Fig. 8) (Segault 1992). Ce domaine possède 3 structures en tige-boucle (hélices 2, 3 et 4) dont les séquences ne sont pas conservées chez les levures et qui peuvent être, partiellement toutes ensemble ou entièrement individuellement, tronquées sans affecter la biogenèse de la particule U3 et sa fonction (Samarsky & Fournier, 1998). Le domaine 3’ possède également 2 couples de boîtes de type C/D formant 2 motifs se structurant en K-turn (Watkins 2000, Marmier-Gourrier 2003, Moore 2004), retrouvés chez tous les snoARN à boîtes C/D. Ces 2 motifs sont conservés à travers l’évolution et sont nommés C’/D et B/C (Fig. 8) (Wise & Weiner 1980, Hughes 1987, Tycowski 1993 ; Watkins et al, 2000 ; Marmier-Gourrier et al, 2001 ; Ségault et al, 2001). La structuration en K-turn dépend de la combinaison de 2 hélices stables et conservées (hélices I et II) séparées par une boucle interne asymétrique. Cette boucle est constituée de 5 nucléotides en 5’ et de 2 nucléotides en 3’, appartenant respectivement aux boîtes C’ ou C et D ou B, et dont deux nucléotides forment deux appariements non-canoniques de type G-A qui s’empilent sur l’hélice II (Fig. 8). Cette structure en K-turn entraine la formation d’un angle de 60° entre les hélices I et II, permettant l’exposition de l’uridine en position 3 de la boîte C’ ou C en dehors de la boucle interne. Ce nucléotide U3 joue ensuite un rôle dans le recrutement des protéines reconnaissant spécifiquement ce type de structure, comme les protéines de la famille L7Ae telles que Snu13P chez la levure et 15.5K chez l’homme (Watkins

et al, 2000 ; Marmier-Gourrier et al, 2001, 2003 ; Clery et al, 2007). La résolution de la structure tridimensionnelle de l’interaction entre la protéine 15.5K et le snRNA U4 contenant un K-turn a été résolue (Vidovic et al, 2000) (Fig. 9).

Dans le cas du snoARN U3, le motif C’/D s’associe aux protéines cœurs retrouvées dans les snoRNP à boîtes C/D (Snu13p, Nop1p, Nop56p et Nop58p), alors que le motif B/C recrute la protéine Snu13p et une protéine spécifique au snoARN U3, la protéine Rrp9p (Fig. 8) (Hartshorne & Agabian, 1994 ; Jeppesen et al, 1988 ; Mereau

Figure 9 : Représentation tridimensionnelle du K-turn formé par le snARN U4 humain en complexe avec la protéine 15.5K (PDB : 1E7K ; Vidovic et al, 2000)

La structuration en K-turn repose sur un arrangement hélice/boucle/hélice. La boucle interne asymétrique est constituée d’un côté de 5 nucléotides (boîte C), dont 3 non-appariés (A1, A2 et U3 représentés en orange et rouge) et 2 appariés (G4 et A5, représentés en jaune), et de l’autre côté de 2 nucléotides (boîte D) appariés (G6 et A7, représentés également en jaune). Au sein de cette boucle interne sont donc formés deux appariements non canoniques G-A et A-G consécutifs (représentés en jaune). Cette boucle est flanquée de deux hélices I et II (représentées en vert). La structuration en K-turn permet l’expulsion de l’uridine en position 3 (U3, représentée en rouge), qui vient s’insérer au sein de la protéine 15.5K (représentée en bleu) permettant son recrutement. Cette structuration en K-turn induit également une forte courbure du squelette phosphodiester de 60° entre les deux hélices.

Introduction

  23 

et al, 1997 ; Parker & Steitz, 1987) (Watkins et al, 2000 ; Venema et al, 2000 ; Lukowiack et al, 2000 ; Granneman et al, 2002 ; Clery et al, 2007). L’ensemble de ces protéines participe à la formation et à la stabilité de la particule U3, à son adressage nucléolaire ainsi qu’à sa fonction.

Les motifs C’/D et B/C présents au sein du domaine 3’ du snoARN U3 présentent quelques différences par rapport à la séquence canonique des motifs C/D classiques, mais ces différences ne perturbent pas la possibilité de former la structuration en K-turn. On note seulement une plus faible affinité du motif C’/D pour la protéine Snu13p chez S. cerevisiae, du fait de la présence d’une uridine à la place d’une adénine en postion 2 du K-turn (Marmier-Gourrier et al, 2003 ; thèse de N. Rolland) (Fig. 10).

Le motif C’/D du snoARN U3 humain présente lui aussi une différence de séquence par rapport au motif consensus. En effet, des nucléotides G3 et A8 sont retrouvés à la place de deux uridines, présentes à ces positions dans les motifs C/D (Fig. 10). Ces différences de séquences ne sont donc pas sans conséquences puisqu’elles font des motifs C’/D des snoARN U3 des motifs sous-optimaux pour la fixation des protéines Snu13p chez la levure et son homologue humain 15.5K. Chez l’homme, la présence d’une guanine en position 3 comme nucléotide protubérant au lieu d’une uridine donne lieu à un mécanisme de régulation de l’assemblage de la snoRNP U3 (Knox et al, 2011). En ce qui concerne le motif B/C, la séquence de sa boucle interne est identique à celle des motifs C/D classiques, mais la séquence de l’hélice II est légèrement différente, avec la présence de deux appariements G9-C12 et A10-U11, retrouvés dans les motifs C/D canoniques, qui sont inversés (C9-G12 et U10-A11) aussi bien chez Saccharomyces cerevisiae que chez l’homme (Fig. 10). De plus, l’hélice I bordant le motif B/C n’est constituée que d’un seul appariement G-C, contrairement à ce qui est observé dans les motifs C/D classiques où la taille et la séquence de l’hélice I sont variables (Fig. 10) (Marmier-Gourrier et al, 2003). Les motifs C’/D et B/C du snoARN U3 ont également la particularité de posséder un nucléotide G en position 1 dans la boucle interne. Ce nucléotide est conservé au sein de la plupart des snoARN U3 mais pas dans les autres snoARN à boîtes C/D, où n’importe quel nucléotide peut être rencontré (Fig. 10). Ce résidu G1 dans le motif B/C est nécessaire comme nous le verrons, pour la fixation de la protéine Rrp9p (Clery et al, 2007). De plus, un appariement U8-U13 est présent au sein de l’hélice II dans les motifs C/D, alors qu’un appariement G8-C13 est retrouvé dans le motif en

Figure 10 : Différences de séquences et de structures entre les motifs C/D, C’/D et B/C chez

Saccharomyces cerevisiae et chez l’homme

Les séquences primaires et secondaires des motifs C/D canoniques, C’/D et B/C chez Saccharomyces

cerevisiae et chez l’homme sont représentées. Les boîtes C et C’ (représentées en rouge), ainsi que D et B (représentées en vert) forment les différents motifs structurés en K-turn. Les positions des différents nucléotides sont annotées. Au niveau des tableaux les différences entre les séquences canoniques C/D et les séquences C’/D ou B/C sont surlignées en rouge, tandis qu’au niveau des structures secondaires, ces différences sont représentées en orange, vert clair ou gris.

Introduction

  24 

K-turn du snARN U4. Il est intéressant de noter que suivant quelles protéines sont associées avec la protéine Snu13p sur un motif en K-turn, la séquence de l’hélice II varie, ce qui doit assurer la spécificité de reconnaissance des protéines se liant avec la protéine Snu13p. Nous venons de voir ce type de différence pour la boîte B/C du snoARN U3, mais c’est aussi le cas pour la structure en K-turn du snARN U4 qui fixe la protéine Snu13p et la protéine Prp31 (Schultz et al, 2006 ; Liu et al, 2007 ; Nottrott

et al, 1999, 2002 ; Vidovic et al, 2000 ; Watkins et al, 2000)

La distance qui sépare les deux motifs C’/D et B/C est fortement conservée et primordiale à la fonction de la snoRNP U3 (Marmier-Gourrier & Rolland, com perso). Au laboratoire, des études génétiques visant à tester l’effet du raccourcissement ou de l’allongement d’un demi-tour (soit 5 pb) ou d’un tour complet d’hélice (soit 10 pb) entre les deux motifs C’/D et B/C ont été réalisées. Chez S. cerevisiae, le raccourcissement d’un demi-tour d’hélice conduit à une croissance normale à 30°C mais ralentie à 20 et 37°C. Un raccourcissement d’un tour complet, ou le rallongement quel qu’il soit, conduisent à l’abolition de la croissance, traduisant un défaut de fonction de la snoRNP U3 sans toutefois affecter sa stabilité. Il a ainsi été conclu qu’en plus de la stabilité du snoARN U3, l’intégrité du domaine 5’ et la présence de la protéine Rrp9P, la distance entre les deux motifs C’/D et B/C est essentielle à la fonctionnalité de la snoRNP U3 (thèse de N. Rolland). Il semblerait également qu’une certaine flexibilité de l’hélice située entre les deux motifs soit requise pour une stabilité et une fonction optimales de la snoRNP U3. En effet, la rigidification de cette hélice, en permettant des appariements non retrouvés classiquement au niveau de l’hélice II, abolit la croissance tandis que la stabilité du snoARN U3 chute fortement (Thèse de N. Rolland et thèse de N. Marmier-Gourrier).