C.   Gradients de saccharose 5-45%

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2%). d’intérêt. Après 2 jours d’incubation à 30°C, les souches diploïdes potentiellement générées sont diluées séparément dans 50 µL d’eau stérile, avant d’être sélectionnées par le dépôt d’un volume de 8 µL de chaque sur un milieu solide sélectif (Trp-, Leu-). Après quelques jours d’incubation à 30°C, les souches diploïdes sont à nouveau diluées séparément dans 50 µL d’eau stérile, avant de tester l’interaction entre les deux protéines d’intérêt par des dépôts de 8 µL de chaque sur milieu solide sélectif (Trp-, Leu-, His-, différentes concentrations en 3-AT (SIGMA) : 0 ; 2,5 ; 5 ; 10 ; 20 ; 40 mM). His-). Le niveau de croissance est analysé après plusieurs jours d’incubation à 30°C.

II.6.C.

Gradients de saccharose 5-45%

Cette manipulation a été effectuée au sein du laboratoire de D. Lafontaine à l’université libre de Bruxelles (ULB) La première étape est de générer le gradient de saccharose 5-45% dans du tampon. Deux techniques ont été utilisées. La première consiste en la superposition de plusieurs couches de tampon contenant différentes concentrations en saccharose (Tris-HCl pH 7,4 20 mM, MgCl2 5 mM, KCl 50 mM, DTT 1 mM, saccharose 10 à 50%) avec une étape de congélation entre chaque. Pour ce faire, 2,2 mL de tampon à 50% de saccharose sont ajoutés dans un premier temps dans des tubes adaptés pour l’ultracentrifugation (Bekman Ultra-clear 14X89 mm), avant d’être incubés à -80°C pendant 15 min. Par la suite, 2,2 mL de tampon à 40% de saccharose est ajouté et les tubes incubés à -80°C pendant 15 min. Ces étapes sont répétées avec du tampon à 30%, 20% et 10% en saccharose. Une incubation des tubes d’une nuit à 4°C permet de générer le gradient en saccharose 5-45%.

La deuxième technique consiste tout d’abord en la préparation d’un tampon à 31% de saccharose (Tris-acétate pH 7,6 50 mM, NH4Cl 50 mM, MgCl2 12 mM, DTT 1 mM, saccharose 31%), répartis ensuite dans les tubes à ultracentrifugation. Les tubes sont congelés à -80°C pendant 30 min, puis décongelés sur glace pendant 30 min et cette étape est répétée deux fois, afin de générer le gradient en saccharose 5-45%. En parallèle, les extraits cellulaires préparés (cf II.4.B.) sont dosés et une quantité de 30 uDO260nm/mL est déposée délicatement au sommet des tubes contenant le gradient en saccharose, avant d’être centrifugés pendant 3h à 39000 rpm à 4°C à l’aide d’une ultracentrifugeuse L8-70M ultracentrifuge (BECKMAN) et en utilisant le

Matériels & Méthodes

  128 

rotor SW41. Les différentes fractions sont collectées en utilisant le collecteur de fractions Foxy® R1 Teledyne ISCO (BRS) afin d’obtenir 24 fractions de 500 µL. La moitié de chaque fraction est ensuite répartie dans des séries de tubes, destinées soit à une expérience de Northern Blot, soit à une expérience de Western Blot (cf II.4.D. et II.5.)

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Résultats & Discussion

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Présentation de l’article soumis

à Nucleic Acids Research

I. Identification de résidus de la protéine Rrp9p impliqués dans

sa fonction

Le rôle précis de la protéine Rrp9p n’étant pas connu, nous avons cherché à identifier des résidus pouvant être impliqués dans sa fonction, ce qui était susceptible de nous renseigner sur son/ses rôle(s) dans la cellule.

Ainsi, dans un premier temps, un modèle de la structure tridimensionnelle du domaine « hélix propeller » des protéines Rrp9p et U3-55K a été réalisé par C. Charron au laboratoire. Ce modèle a été établi par des logiciels utilisant l’homologie structurale avec la protéine GBB1 (Heterotrimeric guanine nucléotide-binding protein ou G proteins), qui contient également 7 domaines WD40 organisés en domaine « hélix propeller » et dont la structure tridimensionnelle avait été établie par radiocristallographie (PDB : 1GG2). Toutefois, GBB1 a une toute autre fonction que les protéines Rrp9p et U3-55K (Sprang et al, 1997), puisqu’elle est impliquée dans la signalisation cellulaire en réponse à des stimuli extérieurs. Afin d’identifier les résidus potentiellement impliqués dans la fonction de la protéine Rrp9p, un ensemble de mutants de Rrp9p ont été produits par N. Rolland, V. Igel-Bourguignon et E. Philippe, un à trois résidus étaient substitués par une alanine dans chaque mutant (Fig. 24). L’hypothèse que Rrp9p joue un rôle de plateforme en interagissant avec d’autres composants du processome a été formulée. L’idée était que l’interaction met en jeu les acides aminés accessibles à la surface des deux faces du domaine « hélix propeller ». Les acides aminés exposés à la surface au sein des boucles reliant les différents domaines WD40, non conservés dans GBB1 mais conservés entre Rrp9p et U3-55K, ont été mutés. On pouvait en effet supposer que ceux conservés dans GBB1 ont un rôle structural et que les acides aminés impliqués dans l’assemblage ou l’activité du processome soient conservés au cours de l’évolution. Les résidus structuraux formant les brins β des domaines WD40 nécessaires à la structuration en « hélix propeller » n’ont pas été mutés (Fig. 24).

La structure tridimensionnelle du domaine « hélix propeller » des protéines Rrp9p et U3-55K a depuis été résolue par radiocristallographie par le groupe de Ye (Zhang et

Figure 24 : Représentation des résidus de la protéine Rrp9p susceptibles d’être impliqués dans sa fonction.

Différents résidus de la protéine Rrp9p ont été sélectionnés comme étant potentiellement importants pour sa fonction et ont été mutés en alanine, par série de une à trois substitutions simultanées, afin de générer les mutants de la protéine Rrp9p indiqués dans l’encart à droite. La fonctionnalité de ces mutants a été testée dans la souche W303::pGAL-RRP9. Les différents résidus mutés sont indiqués au sein de la structure tridimensionnelle de la protéine Rrp9p (Zhang et al, 2013 ; PDB : 4J0X). Ils sont sont représentés en orange, à part le résidu R289 qui a été montré important pour la fonction de la protéine Rrp9p qui est représenté en rouge. Ces images ont été réalisées à l’aide du logiciel Pymol.

Résultats & Discussion

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al, 2013). Ceci nous a permis de confirmer que nos modèles reflétaient bien la structure 3D des deux protéines.