L’étude présentée précédemment visait à analyser l’impact de la déficience en TSSP sur le développement du répertoire T CD4 autoréactif chez la souris NOD. L’analyse comparative de la réponse des souris NOD et NOD Tssp° à divers antigènes associés au DT1, montre que, contrairement aux souris NOD, les souris NOD Tssp° sont partiellement tolérantes à la protéine S100β, un antigène soupçonné de participer à l’initiation du DT1. Les souris NOD Tssp° sont aussi partiellement tolérantes à l’épitope immunodominant, S100β1-15, qui est commun aux deux souches. Cette tolérance est
induite dans le thymus à la fois par les TEC et par les DC thymique.
Nous avons voulu déterminer quelles étaient les particularités du répertoire autoréactif T CD4 spécifique de S100β. Les souris NOD Tssp° semblent avoir des mécanismes de tolérance plus efficace que les souris sauvages. Nous avons voulu évaluer comment un renforcement de la tolérance envers un antigène du soi peut modifier ce répertoire. Pour cela, nous avons dérivé un grand nombre d’hybridomes T CD4 spécifiques de S100β1-15 après immunisation de souris NOD et NOD Tssp° avec le
peptide correspondant. Bien que le répertoire TCRαβ exprimé par ces hybridomes soit relativement divers, trois réarrangements publics de relativement faible avidité pour l’antigène dominent les répertoires avec un biais vers une forte conservation des séquences CDR3α. A l’exception d’un réarrangement, ce répertoire public est fortement conservé entre les deux souches de souris. Inversement, les cellules de forte avidité pour S100β1-15 exprimant un répertoire privé sont présentent dans le répertoire NOD
mais quasi-absente du répertoire NOD Tssp°. Ainsi, l’augmentation de la tolérance centrale chez les souris NOD Tssp° entraîne la délétion de LT CD4 spécifiques de S100β1-15 exprimant un répertoire TCR privé de forte avidité pour l’antigène. Au cours
de cette étude, nous n’avons pas utilisé de tétramère I-Ag7:S100β1-15 Bien qu’étant
de Kappler, des travaux du groupe de Evavold suggèrent qu’une proportion importante de cellules T CD4 de faible affinité pour un antigène donné ne seraient pas marquée par un tétramère pCMH-II spécifique (Crawford et al., 2011; Sabatino et al., 2011; Stadinski et al., 2010b). De plus, étant données la faible capacité du CMH-II I-Ag7 à lier des
peptides et la possible existence de plusieurs registre de liaison du peptide S100β1-15
dans le contexte de ce CMH-II, l’utilisation d’un tétramère I-Ag7:S100β1-15 aurait pu
conduire à l’apparition d’artefact ou à une moindre sensibilité de nos analyses.
Les thymocytes exprimant les TCR 1W01 ou 1W31 se développent normalement chez des souris déficientes en TSSP
Afin d’analyser plus précisément le développement de LT CD4 exprimant un TCR spécifique de S100β1-15, nous avons généré des souris rétrogéniques pour deux TCR
exprimés parmi le répertoire privé des souris NOD WT, 1W01 et 1W31 (voir table S1 de l’article) qui sont respectivement de forte et de faible avidité pour S100β1-15 (Holst
et al., 2006; Viret et al., 2012). Brièvement, à partir d’ARN extrait des hybridomes correspondant, nous avons généré un plasmide codant pour les chaînes α et β réarrangées du TCR. Ce plasmide a été utilisé pour produire un vecteur rétroviral afin de transduire des cellules souches hématopoïétiques (CSH) isolées de souris NOD déficiente en RAG et qui ne peuvent donc pas réarranger les chaînes du TCR dans le thymus. Ces cellules ont été injectées à des souris NOD Tssp° et WT portant une mutation dans la partie constante de la chaîne α du TCR (Cα°) irradiées létalement (900 rad) conjointement avec de la moelle osseuse isolée de souris NOD SCID Tssp° ou NOD SCID WT qui fournira des APC hématopoïétiques dans le thymus. Ainsi, dans ces souris, le TCR qui peut être exprimé est celui transduit dans les CSH. Le développement de thymocytes exprimant le TCR d’intérêt dans le thymus a été analysé par cytométrie en flux 6 à 8 semaines après reconstitution. Le TCR 1W01 est associé à un hybridome de forte avidité pour S100β1-15 appartenant au répertoire privé des souris NOD WT.
Sachant que le répertoire privé de haute avidité est fortement réduit dans les hybridomes de souris NOD Tssp°, ce TCR pourrait potentiellement être éliminé dans le thymus de ces souris. Le TCR 1W31 appartient également au répertoire privé des souris NOD WT mais il est associé à un hybridome de faible avidité. Le répertoire privé sauvage comporte également un second TCR qui diffère de seulement un acide aminé
dans la région CDR3β. Ces TCR sont surreprésentés dans le répertoire privé des hybridomes de souris NOD WT résultant probablement de l’expansion de deux clones dans une seule fusion. Dans un premier temps, nous avons voulu déterminer si les thymocytes exprimant ces TCR se développaient de façon équivalente en présence ou non de TSSP. Les cellules exprimant le TCR 1W01 ou le TCR 1W31 se développent de façon équivalente dans le thymus des souris sauvages et déficientes en TSSP (Figures 19 et 20). Les populations DP et SP CD4 sont équivalente en termes de fréquence, de nombre absolu et de niveau d’expression du TCR. Ces résultats ne sont pas surprenant dans la mesure où ces TCR proviennent du répertoire privé des souris NOD WT. Bien que la taille du répertoire privé de haute avidité spécifique de S100β1-15 soit
drastiquement réduite chez les souris NOD Tssp° (13,6% du répertoire privé total chez les souris NOD Tssp° contre 42,1% chez les souris NOD WT), quelques TCR de haute avidité se développent tout de même. Par définition, le répertoire T privé est spécifique à chaque souris. Etant donné le caractère privé des TCR analysés, il est possible que bien que nous ne les ayons pas identifiés dans nos différentes campagnes d’hybridomes NOD Tssp°, ceux-ci soient tout à fait capables de se développer chez ces souris.
Figure 19 : Développement normal de thymocytes exprimant le TCR 1W01 dans le thymus des souris déficientes pour TSSP.
Des souris rétrogéniques pour le TCR 1W01 ont été générée par co-injection de CSH rétrotransduite (CSHrg) avec une moelle osseuse de souris NOD SCID WT ou NOD SCID Tssp° dans des receveurs NOD Cα° WT ou NOD Cα° Tssp° respectivement. Deux groupes de souris ont été générés, WT (CSHrg + NOD SCID WT -> NOD Cα° WT) et KO (CSHrg + NOD SCID Tssp° -> NOD Cα° Tssp°). A) les profils d’expression des molécules CD4 et CD8 ainsi que le niveau d’expression de la chaîne β du TCR à la surface des DP et des SP CD4 est montré pour une souris représentative de chaque groupe. Le contrôle négatif correspond aux DP de la même souris sans marquage TCRβ. B) La fréquence et le nombre absolu des populations DP et SP CD4 sont montrés. Les erreurs standards de la moyenne sont montrées. Les données ont été analysées par un test de Mann-Whitney bilatéral. Aucune différence significative n’a été observée. Les données présentées sont le bilan de 3 expériences indépendantes pour un total de 6 souris WT et 8 souris KO traitées individuellement.
Figure 20 : Développement normal de thymocytes exprimant le TCR 1W31 dans le thymus des souris déficientes pour TSSP.
Des souris rétrogéniques pour le TCR 1W31 ont été générée par co-injection de CSH rétrotransduite (CSHrg) avec une moelle osseuse de souris NOD SCID WT ou NOD SCID Tssp° dans des receveurs NOD Cα° WT ou NOD Cα° Tssp° respectivement. Deux groupes de souris ont été générés, WT (CSHrg + NOD SCID WT -> NOD Cα° WT) et KO (CSHrg + NOD SCID Tssp° -> NOD Cα° Tssp°). A) les profils d’expression des molécules CD4 et CD8 ainsi que le niveau d’expression de la chaîne β du TCR à la surface des DP et des SP CD4 est montré pour une souris représentative de chaque groupe. Le contrôle négatif correspond aux DP de la même souris sans marquage TCRβ. B) La fréquence et le nombre absolu des populations DP et SP CD4 sont montrés. Les erreurs standards de la moyenne sont montrées. Les données ont été analysées par un test de Mann-Whitney bilatéral. Aucune différence significative n’a été observée. Les données présentées sont le bilan de 3 expériences indépendantes pour un total de 9 souris WT et 9 souris KO traitées individuellement.
Comme décrit en introduction les LT autospécifiques qui échappent à la sélection négative peuvent être contrôlé en périphérie par des mécanismes de tolérance, notamment par l’induction d’anergie (Khoury and Sayegh, 2004; Perez et al., 1997; Schwartz, 2003). Ce phénotype se traduit par l’absence d’activation et de prolifération des LT anergiques après stimulation de leur TCR par l’antigène dont ils sont spécifiques. Nous avons émis l’hypothèse que, bien que les thymocytes exprimant les TCR 1W01 et 1W31 semblent se développer normalement dans le thymus des souris déficientes en TSSP, ceux-ci pourraient être anergiques. Afin d’évaluer cette hypothèse, nous avons analysé la réponse de splénocytes issus de souris rétrogéniques pour le TCR 1W31 au peptide S100β1-15. Nous avons effectué une gamme de titration de cellules et avons
évalué le nombre de LT CD4 par puits par cytométrie de flux. Bien que la réponse soit variable entre les individus, les LT CD4 de souris rétrogéniques 1W31 sauvages ou déficientes en TSSP semblent répondre de façon équivalente (Figure 21). Ce résultat préliminaire suggère que les thymocytes 1W31 de souris rétrogéniques déficientes en TSSP ne sont pas anergiques.
Figure 21 : Réponse équivalente des LT CD4 de souris rétrogéniques 1W31 sauvages ou déficientes en TSSP au peptide S100β1-15
Des splénocytes de souris rétrogéniques 1W31 WT ou KO ont été stimulé avec 50µg/ml de peptide S100β1-15. Trois jours plus tard, la prolifération des cellules a été analysée
par incorporation de thymidine tritiée. Les mesures obtenues à partir des LT CD4 isolés de souris rétrogéniques A) WT ou B) KO sont représentés en dCPM (échantillon – bruit de fond). Chaque ligne correspond à une souris. C) Les données ont été analysées par régression exponentielle et les courbes calculées sont montrées. Les données présentées sont le bilan de 2 expériences indépendantes pour un total de 10 rétrogéniques WT et 9 rétrogéniques KO traitées individuellement