Résultats des expériences préliminaires

Bien qu’aucun résultat correspondant directement aux expériences ultimement prévues dans la démarche expérimentale proposée ne fût obtenu, le nombre important d’expériences préliminaires qui furent conduites, ont permis d’estimer qu’elles devraient être présentées. Ces résultats préliminaires pourraient être utiles aux éventuels utilisateurs de l’ELPI+ visant l’analyse d’échantillons biologiques.

3.3.1. Graisse «Apiezon-L»

La quasi absence d’études disponibles dans la littérature conjuguant l’utilisation de l’ELPI avec des échantillons biologiques, et encore moins avec des particules virales, a soulevé quelques inquiétudes. Afin de savoir si la graisse spécialement formulée par le fabricant avait une influence sur la détection du matériel génétique des virus, des expériences comparatives ont été effectuées.

La vérification de l’influence de la graisse semi-solide Apiezon-L sur la réaction qPCR fut effectuée en enduisant 9 feuillets irradiés de la substance avec un pinceau également irradié. Sur les feuillets enduits, 2 X 10 µl d’une suspension de bactériophage MS2 à une concentration de 10E_{10 ufp/ml furent déposés et} laissés à sécher sous une hotte à flux laminaire pendant 1 heure. Les feuillets ont ensuite été élués dans 1 ml de tampon de phage contenu dans 9 microtubes. Dans un dixième microtube, 2 X 10 µl de la suspension de phages furent directement injectés dans 1 ml de tampon de phage comme contrôle positif. Ces échantillons furent directement traités en microbiologie moléculaire selon les protocoles mentionnés au chapitre précédent. Les résultats sont présentés à la figure 15. Le taux de récupération de génomes observé permis de conclure qu’il n’y avait aucune interaction entre la graisse et les autres réactifs de l’analyse.

Toutefois, comme cette expérience ne correspondait pas réellement à la réalité, à savoir que les particules impactées sur la graisse entreraient plus profondément dans la matrice de la substance qu’un simple assèchement à l’air, un test comparatif fut effectué entre le glycérol et la graisse. Dans la chambre rotative, un nébulisat de bactériophage phi6 purifié dans le tampon de phage fluorescent à 10E_{8 ufp/ml fut généré} jusqu’à l’obtention d’une humidité relative de 40,6%, et une concentration de particules à 11,6 mg/m3_{. Les} aérosols ont été laissés à murir pendant 10 minutes. L’échantillonnage de l’air fut exécuté avec la colonne préparée avec les feuillets d’aluminium enduits de graisse pendant 10 minutes. Les échantillons furent élués dans 1 ml de tampon de phage et préservés à 4°C. Immédiatement après, l’expérience fut répétée avec la colonne préparée avec du glycérol. La nébulisation fut effectuée jusqu’à l’obtention d’une humidité relative de 40,3%, et une concentration de particules de 11,7 mg/m3_{. Les résultats sont présentés à la} figure 16 et ont suggéré que la graisse était plus efficace que le glycérol à collecter les particules virales.

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Figure 15. Effet de la graisse Apiezon-L sur la réaction qPCR. Les résultats obtenus suggèrent que la graisse Apiezon-L n’a pas d’influence sur le nombre de génomes détectés par qPCR dans les conditions du système étudié.

Figure 16. Comparaison du rendement de récupération entre la graisse et le glycérol. Bien qu’aucune statistique n’ait été effectuée, les résultats suggèrent que la graisse permet de récupérer une plus grande quantité de génomes de virus que le glycérol.

1,00E+06 1,00E+07 1,00E+08 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Positif N ombr e de g én omes récu pé rés po ur 2.00 E 8 dé po sés

Substrats d'impaction (n =9)

Numéros des fractions analysés

Graisse Glycérol

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3.3.2. Canaux de courants négatifs

Dès le début des expériences d‘optimisation, des comportements inattendus pouvaient être observés dans les patrons de distribution des charges des particules. De nombreux canaux de courants présentaient des signaux négatifs, ce qui empêchait l’appareil de détecter le nombre de particules. Comme l’objectif premier est de pouvoir déterminer le nombre de copies de génomes par particule, il n’était pas possible de poursuivre l’optimisation sans résoudre ce problème.

Selon le fabricant, les valeurs de courant négatif auraient pu être dues à un débalancement de l’électromètre, à des changements soudains de concentrations de particules ou à une correction erronée de l’algorithme de correction. Suite à quelques analyses, nous en sommes venus à la conclusion que la cause principale du problème était la dernière possibilité. Plus précisément, l’algorithme de correction a tendance à « surcorriger » lorsqu’en présence de grandes concentrations de particules nanométriques, ce qui empêche le compte des particules de plus grandes dimensions. En d’autres mots, les fonctions logicielles ne peuvent processer toutes les données en même temps à cause d’une surcharge de particules nanométriques.

3.3.2.1. Tampon de phage, liquide fluorescent, lysat de phage ou poussières

Afin de trouver laquelle des composantes des systèmes créés était responsable de ces problèmes, chacune d’elle fut nébulisée, ou aérosolisée, seule. Les lectures visuelles sur les moniteurs ont permis de déterminer que le lysat de phages créait plus de canaux de courant négatifs.

3.3.2.2. Lysat de phages ou bactériophages purifiés

Le même exercice fut exécuté en comparant le lysat de phages et la suspension de phages purifiée. Les résultats démontrèrent que la suspension de phages démontrait moins de canaux de courant négatifs.

3.3.2.3. Chargeur ON et chargeur OFF

Croyant que possiblement le problème majeur provenait des charges intrinsèques de nos aérosols, nous avons effectués un test comparatif d’une nébulisation avec le chargeur en fonction (ON) et le chargeur hors fonction (OFF). En effet, le manuel du fabricant précise que si le nombre de particules avec le chargeur OFF est plus grand que 30 à 50% du nombre de particules avec le chargeur ON, il est nécessaire d’utiliser un neutraliseur de particules. Les résultats multiples d’une nébulisation avec 10E₉ ufp/ml de phages purifiés dans le tampon fluorescent à 18,2 mg/m3 _{de particules et 30,2% d’humidité} relative ont systématiquement présenté des concentrations de particules inférieures lorsque le chargeur était OFF. Ces résultats ont démontré que les capacités de charge du chargeur de l’appareil étaient efficaces pour nos applications.

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3.3.3. Tailles de particules virales après 18 heures

Des essais ont été effectués dans le but de faire la preuve du principe que les virus pourraient se comporter différemment selon s’ils étaient conébulisés avec les poussières standardisées ou non. À une température de 20°C, une solution de bactériophage MS2 à concentration finale de 4 X10E_{9 ufp/ml} provenant d’une suspension de phages purifiés fut nébulisée seule dans la chambre rotative jusqu’à obtention d’un taux d’humidité relative de 30,7%, la concentration de particules était de 48,6 mg/m3_{. La} taille médiane de masse des particules était de 0,865 µm. Le système fut laissé en fonction pendant 18 heures et les paramètres de taille médiane de masse et de concentrations furent mesurés. Cette expérience fut répétée une seconde fois dans des conditions comparables. Deux autres expériences furent ensuite conduites cette fois avec une concentration de 1,41 mg/m3 _{et 2,25 mg/m}3 _{de poussières A2} préalablement dispersées au moment de la nébulisation. Les résultats sont présentés à la figure 17. Ces résultats ont démontré que la taille médiane de masse des particules toujours en suspension n’était pas modifiée significativement après 18 heures alors que les concentrations avaient diminué significativement. Il n’est pas possible de déterminer si il y a eu ou non agglutination des particules dans la chambre rotative avant qu’elles ne sédimentent avec la démarche expérimentale utilisé car le suivi de la distribution des tailles n’a pas été fait en temps réel. Toutefois, ces résultats suggèrent qu’il serait raisonnable de reconduire ces expériences avec un temps de maturation plus court et un suivi de la distribution des particules en suspension plus rapproché.

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Figure 17. Variations de la taille et des concentrations des aérosols viraux après 18 heures. Aucune variation des tailles de particules ne fut observée dans le temps (P=0,727, two-way ANOVA), ni de par la présence ou l’absence de poussières dans le système (P=0,968, two-way ANOVA). Une variation significative de la concentration des particules fut toutefois observée dans le temps (P=0,019, two-way ANOVA), alors que la présence ou l’absence de poussières n’a eu aucun effet sur les concentrations temps (P=0,816, two-way ANOVA). Ces résultats suggèrent qu’il soit possible qu’un agglutinement des particules ait eu lieu, mais que la démarche expérimentale n’était pas adéquate pour en faire l’observation.

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