2. Chapitre I
2.2.8. Analyse par biologie moléculaire
À l’arrivée au laboratoire, les microtubes contenant les demi-filtres ont immédiatement été agités de 45 à 60 minutes sur un multi vortex à vélocité moyenne à la température de la pièce. Ils ont ensuite été conservés à -80 °C jusqu’à l’extraction des acides nucléiques.
2.2.8.1. Extraction
Pour procéder à l’extraction des ARN, les échantillons ont été décongelés sur glace. La trousse commerciale « QIAmp Viral RNA Mini Kit » de Qiagen fut utilisée selon les instructions du fabricant, à l’exception de l’omission de la solution de « carrier-RNA », comme il fut suggéré par des expériences d’optimisation précédentes (Gendron et al. 2010). Ainsi, 130 µl de chaque échantillon ont été utilisés pour l’extraction et une élution double des colonnes fut exécutée en utilisant 2 X 40 µl de tampon IDTE (Tris- EDTA pH 8,0, IDT Technologies). Dans le but de vérifier l’efficacité et la constance du procédé d’extraction, 10 µl d’une suspension du bactériophage à ARN MS2 de concentration connue (10E10 ufp/ml) fut additionné aux 130 µl de chacun des échantillons. Les contrôles positifs (liquide avant et après nébulisation) et négatifs (blanc de terrain et négatif d’extraction) nécessaires ont été effectués à chaque
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traitement. Vingt µl ont été conservés pour la transcription inverse. Les 60 µl restants des ARN extraits ont été conservés à -80 °C
2.2.8.2. Transcription inverse (RT)
Avant de procéder à la synthèse de l’ADN complémentaire, un choc thermique fut exercé sur les échantillons afin d’assurer la dénaturation des segments double brins (ds) d’ARN de phi6. Les 20 µl d’ARN extraits ont été placés dans un bain sec à 105 °C pendant 5 minutes, puis plongés dans un bain de glace pendant 5 minutes (Gendron et al. 2010). La transcription inverse fut exécutée avec la trousse commerciale « iScript cDNA Synthesis Kit » (BioRad) en utilisant 4 µl 5X iScript reaction mix, 1 µl iScript
reverse transcriptase et 15 µl d’échantillon. Le thermoprotocole suggéré par le fabricant fut utilisé dans un
thermocycleur situé dans une pièce séparée (Dyad, Peltier). Les échantillons ont été directement traités en PCR quantitative ou ont été réservés à 4 °C pour quelques heures. Toutefois, les échantillons d’une même série d’essais ont tous été traités de la même façon.
2.2.8.3. PCR quantitative (qPCR)
Les amorces et sondes utilisées pour la détection et la quantification du bactériophage phi6, et du bactériophage MS2 utilisé comme contrôle interne, avaient été optimisés par les membres de l’équipe de Caroline Duchaine et les détails avaient été publiés plus tôt (Gendron et al. 2010).
Dans le but de permettre l’homogénéité des conditions de réactions, les amplifications en PCR quantitative ont été exécutées à l’aide du module de détection CFX384 (BioRad). Étant donné que le nombre de réactions nécessaires pour chacun des essais était généralement autour de 200 cet appareil pouvant effectuer jusqu’à 384 réactions permettait d’effectuer plus facilement les analyses. Pour chaque réaction, 0,125 µl des amorces sens et antisens (forward et reverse) d’une suspension à 50 µM et 0,5 µl de sonde munie du fluorophore Fluorescéine amidite (FAM) provenant d’une suspension à 10 µM ont été utilisés pour chaque réaction de 20 µl. Le thermoprotocole utilisé était : 94°C pendant 3:00 minutes, 95 °C pendant 0:20 minute, 60°C pendant 1 :00 minute, et les deux dernières étapes ont été répétées 39 fois. Tous les échantillons ont été effectués en triplicata.
Une courbe standard préparée à partir d’un plasmide selon une méthode publiée précédemment (Gendron et al, 2010) fut utilisée. Une dilution sériée d’un échantillon contenant une quantité connue de l’amplicon correspondant à la sonde a permis de faire la quantification du nombre de copies de génome. Aucune courbe standard ne fut utilisée pour la quantification du contrôle interne MS2, puisque seule sa présence en quantité constante dans les réplicas permettait de conclure à la validité ou non des manipulations.
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Les valeurs du nombre de copies attribuées ainsi que les analyses ont été effectuées à l’aide du logiciel associé au module de détection « CFX Manager »(BioRad). Les valeurs obtenues par le logiciel ont été transformées dans le but de tenir compte des dilutions et réactifs qui ont été impliqués dans le procédé. Ainsi, pour ramener la valeur obtenue par le logiciel à la valeur correspondant au nombre de génomes par m3 d’air échantillonné, les facteurs suivants doivent être considérés.
1. Un filtre représente 240 L d’air échantillonné (2 L /min pendant 120 minutes), un demi-filtre représente 120 L d’air. Donc, comme 120 L = 0,120 m3 d’air.
Facteur 1 = x copies ÷ 0,120
2. Le filtre est élué dans 500 µl de tampon de phage et seulement 130 µl sont utilisés, soit 0,26 du total de l’élution.
Facteur 2 = Résultat (Facteur 1) ÷ 0,26
3. Tous les génomes de cette extraction sont élués de la colonne d’extraction dans 80 µl de IDTE. Toutefois, seulement 15 µl sont utilisés pour la RT, soit 0,1875 du total de l’élution.
Facteur 3 = Résultat (Facteur1 et Facteur 2) ÷ 0,1875
4. Pour terminer, du volume total de la RT de 20 µl, seuls 2 µl d’échantillon sont utilisés, soit 0,1. Facteur 4 = Résultat (Facteur 1 et Facteur 2 et Facteur 3) ÷ 0,1
Par exemple, si on obtient une valeur de nombre de copies de génomes de 100, et que tous les facteurs sont appliqués, on obtient une valeur de 1,73x10E5 copies du génome par mètre cube d’air.
Afin de comparer les valeurs de recouvrement du nombre de copies du génome pour chaque endroit échantillonné, des paramètres de recouvrement relatif (RR) furent utilisés. Plusieurs variantes de ratios et de valeurs relatives ont été considérées. Toutefois, la méthode de RR retenue s’est basée sur les principes suivants. D’abord, avant de considérer un essai comme étant réussi, les contrôles internes de manipulation en microbiologie moléculaire devaient être positifs et représenter une quantité de copies du génome à l’intérieur de 3,33 cycles, soit approximativement 1 logarithme. Les blancs de terrain, les contrôles négatifs d’extraction, de RT et de qPCR devaient être en deçà du dernier point de la courbe standard de phi6. Ainsi, pour un essai réussi, la valeur de RR a été définie comme la valeur du nombre de copies du génome de phi6 par m3 d’air échantillonné, divisé par la valeur la plus élevée du nombre de copies du génome de phi6 par m3 d’air dans un même essai. Les valeurs ont été exprimées en valeur logarithmique. Les graphiques, de même que les tests statistiques applicables ont été effectués avec le logiciel Prism 5 for Mac, Version 5.0a (GraphPad Software Inc).
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2.2.8.4. Seuil de détection
Il est important de comprendre que plus le dernier point de la courbe standard de l’expérience en qPCR se trouve près de zéro, plus le seuil de détection sera bas. Il faut notamment considérer que la valeur du nombre de copies de l’amplicon utilisé pour effectuer la quantification comporte lui aussi une marge d’erreur qui peut être considérable. Si l’on pose, par exemple, que le point le plus élevé de la courbe standard contient 10E8 copies du génome, alors qu’elle n’en contient que 10E7 ou même 5x10E7, cette fluctuation dans la valeur peut avoir des répercussions inestimables lorsque vient le temps de détecter des concentrations très faibles de génomes viraux dans l’espace. Lors de l’utilisation d’une courbe standard à 7 points d’une dilution sériée au facteur 10, la courbe ayant une valeur au point le plus élevé à 10E8 aura le point le plus bas à 10E2, c’est-à-dire à 100 copies. Si l’on utilise l’exemple plus haut, cela voudrait dire que le seuil de détection de l’expérience serait de 1,73x10E5 copies de génomes par m3 d’air. La valeur du seuil de détection par cette méthode lors des essais d’hiver et d’été 2013 a été estimé à 1,4x10E4 copies par m3 et à 3,4x10E5 à l’hiver 2014. Il convient de noter que ces valeurs ne tiennent pas en compte la marge d’erreur implicite à la quantification de l’amplicon constituant la courbe standard.