Chambre environnementale rotative

La chambre d’aérosolisation qui fut choisie est la chambre environnementale rotative présentée à la figure 4. Cette chambre d’aérosolisation, basée sur le concept de la chambre rotative de Goldberg (Goldberg et al. 1958) consiste en un cylindre d’un volume de 50 litres qui tourne latéralement sur lui- même à vitesse variable. Elle fut conçue spécifiquement pour le vieillissement des aérosols et plusieurs paramètres environnementaux y sont modulables, notamment la température et l’humidité relative. L’environnement intérieur est monitoré à l’aide d’instruments de mesure variés.

3.2.2.2. Instruments de mesure

Certains instruments de mesure fixes, tels que des anémomètres et des manomètres, peuvent être consultés et contrôlés par des valves sur un panneau de contrôle. D’autres instruments de mesure peuvent être ajoutés par des ports d’échantillonnage et ouvertures, tels qu’un compteur de particules, une sonde de température et d’humidité relative. Le compteur de particules utilisé fut l’«Aerodynamic Particle Sizer» (APS) (TSI instruments). Les mesures de température et d’humidité relative ont été obtenues par une sonde installée à l’intérieur du cylindre et les données ont été enregistrées à l’aide du logiciel Kilog (KIMO).

3.2.3. Disperseur de poussières

L’instrument utilisé pour disperser les poussières dans la chambre environnementale rotative était le

«Small Scale Powder Disperser» 3433 (TSI Instruments). Une fine couche des particules à disperser était

étendue sur un disque rotatif sur lequel se pose un capillaire aspirant. Les expériences préliminaires ont permis de déterminer qu’une pression intérieure réglée à 240 psig (le fabricant recommande 155 psig), l’entrée d’air de transport à 20 psig et le réglage de la vitesse de rotation du disque à environ 0,5 révolution/minute, permettaient de générer une concentration maximale de poussières autour de 2,75 mg/m3 _{après 30 minutes. L’efficacité de dispersion de la poussière a toutefois été variable tout au long des} expériences, faisant varier les concentrations de départ à chacune des expériences.

3.2.3.1. Poussières standardisées

Les poussières standardisées possèdent des applications dans plusieurs domaines de recherche et développement dans les systèmes de filtration, l’industrie automobile, les équipements lourds et, bien sûr, la science des aérosols. Les poussières «Arizona Road Dust» homologuées que nous avons utilisées sont les «Ultrafine Test Dust», «Fine Test Dust» et «Medium Test Dust» (ISO 12103-1, A1, A2 et A3, Powder Technologies). Les essais préliminaires avec les trois distributions de tailles ont démontré que la

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poussière fine «Fine Test Dust», A2, permettait de générer la plus grande concentration de poussières en suspension dans la chambre utilisée. La concentration optimale tendait toutefois à diminuer rapidement.

3.2.4. Nébulisation

3.2.4.1. Nébuliseur

La chambre d’aérosolisation contenant 50 L, l’utilisation d’un nébuliseur à plus faible débit était de mise. De plus, il est connu qu’une charge électrostatique se crée spontanément sur les particules lors de la nébulisation (Kwok et al. 2010; Wilkes et al. 1995). Ceci a le potentiel de rendre problématique l’échantillonnage de l’air au moyen d’un impacteur électrique s’il n’est pas possible de neutraliser les particules générées, comme par exemple à l’aide d’un neutraliseur radioactif. Comme nous le verrons un peu plus loin, le principe de l’appareil est basé sur le chargement des particules devant être impactées, en les ramenant à une distribution de charges connue. Or, si par exemple le taux de charges sur certaines particules était trop élevé avant de pénétrer le couloir du chargeur, le chargeur pourrait s’avérer inadéquat. Ainsi, notre choix s’est arrêté sur le nébuliseur «Aeroneb Lab» (Aerogen). Ce dispositif à basse vitesse génère des particules fines par la vibration d’une membrane. Bien que ce nébuliseur produisent une quantité plus élevée de particules chargées négativement que de particules chargées positivement, nous avons estimé qu’une méthode de nébulisation plus douce pourrait amoindrir cet effet (Simones 2014). Le temps de nébulisation a été variable pour toutes les expériences, car l’obtention d’un taux d’humidité relative autour de 30% était la cible. Le débit d’air entrant dans le nébuliseur a été établi à 7 L/minute.

3.2.4.2. Solution de nébulisation

Il fut décidé que les solutions de nébulisation seraient également colorées avec le traceur fluorescent. Bien qu’aucune observation en microscopie n’avait été prévue, il fut toutefois estimé qu’une solution colorée était plus facilement visible, notamment lorsque des fuites se produisent dans le système. La coloration pourrait permettre, par exemple, de distinguer des gouttelettes de condensation de celles provenant d’une fuite laissant échapper du liquide contenant du virus. De plus, si les particules captées par l’échantillonneur électrique subissaient un phénomène de rebond lors de l’impaction à basse pression, une coloration serait visible sur la surface sous-jacente au plateau de l’étage du dessus. L’ajout de colorant fut très utile lorsqu’en effet, des fuites sont survenues à quelques reprises, de même que lorsque les substrats d’impaction n’étaient pas enduits d’une substance adéquate.

De nombreux essais préliminaires ont été exécutés pour tenter de pallier aux difficultés rencontrées lors de l’optimisation du protocole d’utilisation de l’appareil ELPI pour l’utilisation avec des virus. Certains ont été exécutés avec le bactériophage phi6, d’autres avec le bactériophage MS2.

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3.2.5. Échantillonnage de l’air

L’ELPI, est manufacturé et distribué par l’entreprise Dekati Ltd depuis 1995 et est largement utilisé pour les études de la qualité de l’air, des émissions de particules provenant de la combustion, en recherche pharmaceutique et en recherche sur les aérosols atmosphériques (Chen et al. 2015; Gouriou 2004; Virtanen et al. 2010). La version de l’instrument qui fut disponible pour le présent projet est l’ELPI+, adaptation améliorée du modèle précédent. Il fonctionne sur la base de la charge unipolaire des particules, la séparation de ces particules sur un impacteur en cascade et sur la mesure électrique des particules collectées. La schématisation de l’ELPI+ est présentée à la figure 14.

Brièvement, les particules sont introduites dans le chargeur unipolaire qui diffuse des ions positifs proportionnellement à la taille des particules. En d’autres mots, plus la particule est grosse, plus elle sera chargée positivement. Les particules sont ensuite classifiées dans l’impacteur en cascade. Les particules les plus grosses sont d’abord séparées par le «pré-séparateur». Les autres particules suivent le flux d’air dans l’impacteur dont les étages sont séparés par des isolants électriques qui sont connectés à un électromètre multicanal. Les particules chargées positivement sont détectées lors de l’impaction en mesurant la différence de potentiel qui est créée à chaque étage. L’instrument peut être contrôlé par le logiciel interne avec interface tactile ou par un logiciel installé sur un ordinateur indépendant. L’utilisation de l’ordinateur indépendant permet l’extraction directe des fichiers alors que l’utilisation du logiciel interne permet à l’ELPI d’être transporté. Quinze fractions sont exécutées, l’étage 15 consiste à la présélection. Ces particules sont collectées, mais non comptées. L’étage 1 est constitué d’un filtre, et ces particules sont comptées mais non collectées. Les fractions 2 à 14 sont comptées et collectées. Le logiciel compte toutefois les canaux 1 à 14. Le tableau II présente les tailles de particules et leurs étages respectifs.

Il fut rapporté que la charge initiale des particules avait un impact sur la détection (Järvinen 2014). Les particules très chargées positivement seraient responsables de surestimations des populations alors que les particules chargées négativement ne causeraient pas d’effets. Comme les particules générées par le procédé Aeroneb sont chargées négativement (Simones 2014), les deux instruments auraient dû être compatibles. Des essais préliminaires ont été effectués afin de maitriser les composantes de l’appareil. Quelques une d’entre elles sont présentées ici. Toutes les expériences ont été exécutées en échantillonnant pendant 10 minutes à 10 L/minute, le débit étant prédéterminé par la colonne d’impaction elle-même.

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3.2.5.1. Substrats d’aluminium

Un fin feuillet circulaire d’aluminium était d’abord enduit d’une graisse spécifiquement formulée par le fabricant, «Apiezon-L», afin de s’assurer que les particules ne soient pas repoussées par rebondissement lors de l’impaction violente qu’elles subissent. Les feuillets étaient délicatement posés sur les surfaces d’impaction et, suite à l’échantillonnage, ils étaient utilisés au même titre que des filtres.

Comme les substrats n’étaient pas stériles et qu’ils étaient exposés à l’air ambiant, ceux-ci étaient traités des deux côtés avec des radiations UV (Cross-linker XL-1000, Spectrolinker) à raison de 80K µJ/cm2 _dans le but de d’effectuer une décontamination efficace sans abimer la texture parfaitement plate des feuillets.

Des inquiétudes avaient été soulevées concernant la graisse qui pourrait potentiellement interagir avec les échantillons biologiques. Des expériences ont été effectuées pour évaluer les effets de la graisse en la comparant avec le glycérol reconnu pour être inerte. La graisse pouvant être distribuée par le fournisseur sous forme d’aérosol en canette ou semi-solide en pot, les deux conditionnements ont été testés. Toutefois, seuls les résultats des essais comparatifs avec le glycérol sont présentés à la figure 14.

Figure 14. Schéma du ELPI + de Dekati Ltd. Image tirée de Järvinen et al. (2014). ‘Calibration of the new electrical low pressure impactor (ELPI+)’. J Aerosol Sc 69 150-159.

Impacteur pré- séparateur Chargeur Échantillon Impacteur 13 fractions Fraction filtrée Alimentation à haut voltage Électromètre multicanal et mesure de la différence de potentiel Filtre Pompe de rinçage Ordinateur interne et contrôles électro- niques Sonde de pression Sonde de pression Interface intégrée Obtention des données Vide externe

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Tableau II. Correspondance entre les fractions de l’ELPI+ et les tailles des particules

Source : Dekati User Manual, version 1.12 (2011). D50% est l’intervalle la taille médiane alors que Di correspond à la

moyenne géométrique. Les moyennes de tailles peuvent varier selon les colonnes. * : n/d = aucun échantillon

3.2.6. Traitement des échantillons

À la fin des échantillonnages, la colonne de l’impacteur en cascade était retirée et les feuillets d’aluminium étaient élués dans 500 µl à 1 ml de tampon de phage selon les expériences. Les analyses en qPCR étaient conduites de la même façon que celle décrite au chapitre précédent.

Fractions

_{correspondant} # Échantillon

D50% _(µm)

_(µm) D

15

14

10 + (captées, non comptées)

14

13

6,8 – 9,9

8,2

13

12

4,4 – 6,8

5,5

12

11

2,5 – 4,4

3,3

11

10

1,6 – 2,5

2

10

9

1,0 – 1,6

1,3

9

8

0,64 – 0,99

0,8

8

7

0,4 – 0,64

0,51

7

6

0,26 – 0,39

0,32

6

5

0,17 – 0,26

0,21

5

4

0,11 – 0,17

0,14

4

3

0,06 – 0,11

0,08

3

2

0,03 – 0,06

0,042

2

1

0,017 – 0,03

0,022

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