lyse de la variation de l’enthalpie donne des indications sur la possibilité que des
liaisons hydrogènes ou des ponts salins interviennent dans l’interaction. De même,
l’observation de l’entropie du système permet d’étudier des changements
conforma-tionels importants ou une interaction plutôt hydrophobe.
Cette technique permet aussi de déterminer le nombre de sites de liaison et la
stœ-chiométrie de l’interaction. De plus, l’ITC permet d’étudier les molécules libres en
solution (sans immobilisation ou marquage). L’ITC peut être utilisée, quelles que
soient les propriétés optiques de l’échantillon.
Le principe consiste à mesurer la différence de chaleur entre une chambre de
réfé-rence qui contient de l’eau et une chambre de mesure. La capacité calorifique du
tampon des protéines est considérée identique à celle de l’eau. Une des deux
molé-cules à analyser est placée dans la chambre de mesure l’autre molécule est injectée
progressivement dans ce même compartiment. L’instrument mesure la différence de
chaleur (endothermique ou exothermique) pour permettre au système de revenir à
l’équilibre entre les deux chambres.
Lors des expériences effectuées en collaboration avec Andrès Palencia de l’EMBL
Grenoble Outstation, les échantillons de Rev et Impβ sont issus de gel filtrations
équilibrées dans exactement le même tampon (50 mM HEPES pH 7.5, 200 mM
NaCl) et la même colonne de gel filtration a été utilisée (Superdex S200 10/300, GE
Healthcare Life Science). Le calorimètre utilisé était un iTC200 Microcalorimeter,
MinCal. RevV16D/I55N a été placé dans la chambre de mesure à une concentration
de 50 µM (350 µl). Importin β a été dans la seringue à une concentration de 150
µM (préparé 55 µl) et 1.5µl a été injecté toutes les 180 secondes. Les données ont
été analysées à l’aide du logiciel fourni par le fournisseur du calorimètre.
4.12 Résonance Magnétique Nucléaire
La résonance magnétique nucléaire (RMN) réside dans l’utilisation des propriétés
magnétiques des noyaux des atomes placés dans un champ magnétique très intense.
En solution l’aimantation des noyaux des atomes est aléatoire, on utilise alors des
CHAPITRE 4. MATÉRIELS ET MÉTHODES
4.12. RÉSONANCE MAGNÉTIQUE NUCLÉAIRE
bobines supraconductrices plongés dans de l’hélium liquide à 4K pour y appliquer
un champ magnétique. En présence de ce champ magnétique très intense,
l’aiman-tation des noyaux des atomes s’aligne avec le champ externe. Une majorité des spins
s’oriente de manière parallèle mais il reste des spins orientés en antiparallèle et il en
résulte une aimantation macroscopique nette de l’échantillon.
L’échantillon est placé dans un champ magnétique statique, et au moyen d’un second
champ magnétique perpendiculaire de courte durée on peut basculer l’aimantation
des spins des noyaux des atomes. Le retour à l’équilibre (précession) est mesuré via
le courant électrique qu’il induit dans une bobine placé dans le plan perpendiculaire.
Au moyen d’un détecteur on peut suivre le signal électromagnétique émis par les
spins en rotations.
Le signal reçu est traité par une transformation de Fourier, ce qui permet d’obtenir
les fréquences de résonnance des différents noyaux. Celles-ci dépendent du champ
magnétique, c’est ce que l’on appel le déplacement chimique (exprimé en ppm). Ce
dernier est très sensible à l’environnement, ce qui permet d’avoir un spectre
carac-téristique de l’échantillon. Dans le cas des macromolécules biologiques, le spectre
RMN est de base très complexe. Et pour diminuer les ambiguïtés résultantes des
superpositions spectrales issues des atomes d’hydrogène, on utilise la fréquence d’un
ou plusieurs noyau(x) supplémentaire(s) en introduisant des isotopes lourds visible
en RMN (15N et/ou13C).
Une des limites de la méthode et qu’elle ne permet d’étudier que des molécules de
relativement petite taille (100 acides aminés sans marquage, 150 acides aminés avec
15N, 200 acides aminés avec 15N/13C et 300 acides aminés avec 15N/13C/2H).
Dans notre cas, Impβ(98 kDa) est trop grosse pour pouvoir étudier le complexe par
RMN. Il a donc été choisi de marquer RevV16D/I55N. Cela a nécessité d’apporter des
modifications dans le protocole de purification standard de Rev (cf. 4.2.4, page 139).
Une pré-culture de bactéries exprimants Rev a été ensemencée en milieu LB avec de
la kanamycine sur la journée à 37○C. Ensuite les cellules ont été centrifugées à 7750g
pendant 10 min et ont été remises en suspension dans 1 ml de milieu M9 (Tableau
4.1). Ce milieu est composé de15NH4Clavec ou sans13C-glucose. Une préculture de
ce milieu minimum à ensuité été ensemencée sur la nuit à 37○C.
CHAPITRE 4. MATÉRIELS ET MÉTHODES
4.12. RÉSONANCE MAGNÉTIQUE NUCLÉAIRE
TABLEAU 4.1 – Composition du milieu minimum M9 complémenté. La
com-position suivante permet la réalisation d’un litre de milieu minimum M9 complémenté en
vitamines et minéraux. Les différents composants à ajouter (masse, volumes et
concen-tration des solutions stocks) sont présentés. Pour marquer les protéines produites avec de
l’azote (15N), du chlorure d’ammonium a été utilisé. Le carbone lourd (13C) fut apporté
par le glucose. La solution est stérilisée par filtration à 0,2µm.
Quantités Composés
10 Na2HPO4.7H2O
3 KH2PO4
masse (en g) 0,5 NaCl
1 15NH4Cl
2 (13C-)Glucose
1/1 MgSO4
Volume(en ml) 1/0,1 CaCl2
/ Concentration 0,1/0,1 MnCl2
Initiale (M) 1/0,05 ZnSO4
10/- 100X MEM (mix de vitamines)
La culture de la protéine RevV16D/I55N et le début de la purification ont été
iden-tiques au protocole standard. L’étape de gel filtration utilisait le tampon d’analyse
par RMN (25 mM NaH2PO4/Na2HPO4, 150 mM KCl, 1 mM DTT, 1 mM EDTA,
5 mM β-mercaptoéthanol, 0,02% NaN3). RevV16D/I55N marqué a ensuite été mis
dans le tampon de gel filtration avec 10% d’eau deutérée (D2O). 150 µl avec une
concentration de Rev finale de 90 µM ont été préparés. Dans le cas du complexe
avec Impβ, la protéine humaine a été ajoutée à un ratio équimolaire.
L’acquisition des spectres RMN a été effectué par Robert Schneider, Guillaume
Bouvignies et Malene Ringkjøbing Jensen de l’IBS. Les spectres ont été enregistrés à
10○C sur un spectromètre Bruker 600 MHz équipé d’une cryo-sonde. Très brièvement,
il a été utilisé une séquence BEST-TROSY qui a permis l’attribution des spectres
comme c’est reporté dans la bibliographie (Lescop et al., 2007 ; Marion, 2010 ; Solyom
et al., 2013).
CHAPITRE 4. MATÉRIELS ET MÉTHODES
Dans le document
Etude de l'interaction entre la protéine humaine Importin beta et la protéine du VIH-1 Rev
(Page 174-177)