Imp β reconnait Rev par son domaine N-terminal

2.6 Impβ reconnait Rev par son domaine N-terminal

2.6.1 Analyse par RMN de Rev en présence et en absence

d’Impβ

N’ayant pas obtenu de cristaux du complexe entre Impβ et Rev, nous avons décidé

de concentrer nos efforts sur les études biochimiques et biophysiques du complexe,

ainsi que d’autres techniques structurales. Rev étant d’assez petite taille, j’ai

dé-cidé d’élucider la zone de Rev engagée dans l’intéraction avec Impβ en utilisant la

RMN. La protéine RevV16D/I55N donne un spectre RMN caractéristique d’une

pro-téine désordonnée (Figure 2.17 (a)). En e_ffet, le spectre de la protéine possède des

résonances1H entre 7.5 et 8.5 ppm, les protéines ordonnées ayant une dispersion des

déplacements chimiques 1H plus large (Kragelj et al., 2013). Comme nous pouvons

le voir sur cette figure, la zone centrale qui contient les arginines est difficilement

attribuable, car les résonances nucléaires ne sont pas bien séparées. Cette

superposi-tion provient du fait que la quantité d’arginine dans Rev est importante (16 résidus

sur 116, soit 14%).

Lorsque la protéine Impβ est ajoutée à la protéine Rev (Figure 2.17 (b)), certains

pics disparaissent. Globalement ces pics correspondent aux résidus de Rev impliqués

directement dans l’interaction avec Impβ ou qui font partie du même corps rigide

reconnu par Impβ. Les intensités des pics de Rev obtenus en complexe avec Impβ

sont normalisées par rapport à celles obtenues avec Rev seul dans laFigure 2.17

(c). Malgré le fait que beaucoup de résidus entre les résidus N26 et R80 ne sont

pas attribués, nous pouvons voir que la partie de Rev en interaction avec Impβ

correspond au domaine N-terminale, c’est-à-dire l’épingle hélicoïdale (résidus 9-65).

Par contre, les premiers 9 résidus, ainsi que la partie C-terminale (résidus 69-116) qui

contient entre autre le NES, ne semblent pas engagés dans cette interaction.

Ainsi, il semble qu’Impβreconnaît Rev principalement par son domaine N-terminal.

CHAPITRE 2. RÉSULTATS

2.6. IMPβ RECONNAIT REV PAR SON DOMAINE N-TERMINAL

(a) Rev seule _{(b) Rev en complexe avec Imp}β

(c) Intensité des résidus de Rev en présence ou non d’Impβ

Figure2.17 – Spectres RMN de Rev en présence ou non d’Impβ(a) Attributions

sur deux dimensions (1H et15N) de Rev seule. (b) Le spectre RMN de Rev seul (en rouge)

et superposé avec le spectre de Rev en complexe avec Impβ (en bleu). (c) Séquence de

RevV16D/I55N avec les résidus attribués en rouge et les résidus non attribués en noir. Les

prolines non attribuables en RMN sont en cyan. L’intensité relative des pics obtenus en

présence d’Impβ par rapport à Rev seul est montré sous forme de barres bleues.

CHAPITRE 2. RÉSULTATS

2.6. IMPβ RECONNAIT REV PAR SON DOMAINE N-TERMINAL

2.6.2 Identification d’épitopes de liaison par balayage

pepti-dique

Afin de vérifier la partie de Rev reconnue par Impβ, j’ai recouru à une expérience de

fluorimétrie di_fférentielle à balayage (Thermal Shift Assay (TSA)). Cette technique

permet d’étudier la capacité d’une molécule à stabiliser thermiquement une autre

en cas d’interaction. Nous avons tout d’abord testé la faisabilité de cette approche

en étudiant la capacité de Rev entier à stabiliser Impβ. Les résultats de l’expérience

ont montré que RevV16D/I55N augmente de 5.8 ○C le Tm d’Impβ, ce qui représente

un signal robuste (Figure 2.18).

Encouragé par ce résultat, nous avons ensuite utilisé cet essai pour tester différents

peptides chevauchants de Rev provenant duNational Institutes of Health (NIH, Rev

peptide set). Il s’agit de peptides de 15 résidus couvrant toute la séquence de Rev et

ayant un chevauchement de 10 résidus entre eux (Figure 2.19). La plupart des

pep-tides n’améliore pas la stabilité thermique d’Impβ de manière significative (Figure

2.19 (a)). Cependant, 3 peptides augmentent le Tm de plus de 2○C. Ils sont tous

si-tués entre les résidus 33 et les résidus 55, la zone contenant le motif riche en arginine

(ARM ; Figure 2.19 (b)). Comparé à la valeur du Tm obtenue avec Impβ seule

(35.4 ± 0.7 ○C), le peptide Rev34−47 augmente la stabilité thermique de 2.25 ± 0.4

○C, Rev37−51 l’augmente de 3.5 _± 0.7 ○C et Rev41−54 de 2.75_± 0.4 ○C. Ces peptides

couvrent la partie N-terminale de l’hélice α2 de l’épingle hélicoïdale (Figure 2.19

(c)). Ces données sont en accord avec l’observation que l’a_ffinité d’Impβ pour Rev

est compromis par la double mutation R38D/R39L de Rev (Henderson and

Perci-palle, 1997). Une stabilisation moins importante a aussi été observée avec le peptide

couvrant les résidus 9-23 (∆ Tm=1 ○C). Ces résidus correspondent presque

parfai-tement à l’héliceα1. L’ensemble de ces données suggère qu’Impβ interagit avec une

surface assez importante du domaine N-terminal de Rev. Par contre, aucun e_ffet de

stabilisation a été obtenu avec les peptides correspondant au domaine C-terminal

désordonné, confirmant ainsi que ce domaine n’est pas reconnu par Impβ de façon

significative.

CHAPITRE 2. RÉSULTATS

2.6. IMPβ RECONNAIT REV PAR SON DOMAINE N-TERMINAL

Figure2.18 – Fluorimétrie di_fférentielle à balayage d’Impβ seule ou en

com-plexe avec RevV16D/I55N. Courbes normalisées obtenues avec les protéines issues de

gel filtration. Impβ seule est en bleu, le complexe avec RevV16D/I55N en large excès est

en vert. RevV16D/I55N seul, ne donne aucun signal de fluorescence (non montré).

CHAPITRE 2. RÉSULTATS

2.6. IMPβ RECONNAIT REV PAR SON DOMAINE N-TERMINAL

(a)

(b) (c)

Figure 2.19 – TSA d’Impβ en présence de di_fférents peptides de Rev. (a)

Différences de Tm observées entre Impβseule et en présence de divers peptides de Rev.

Les résidus colorés sont les résidus présents dans les peptides de Rev qui augmentent la

stabilité thermique d’Impβ de plus de 2○C. Ces résidus sont présents soit dans un seul

peptide (en vert), dans deux peptides (en orange) ou enfin dans trois peptides (en rouge).

(b) Courbes de TSA obtenues avec les 3 peptides de Rev qui stabilisent Impβ de plus

de 2○C. Impβ seule est en violet, le peptide 5999 (Rev33−47) est en bleu, le peptide 6000

(Rev37−51) est en rouge et le peptide 6001 (Rev41−54) est en vert. (c) Mise en évidence

sur la structure PDB 3LPH des résidus importants pour la stabilisation thermique, avec

le même code couleur que dans la séquence (a).

CHAPITRE 2. RÉSULTATS

2.7. REV FIXE IMPβ AVEC MOINS D’AFFINITÉ QUE LE MOTIF ARM

2.7 Rev fixe Impβ avec moins d’a_ffinité que le motif

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