2.4 Rev et Impβ forment un complexe stable
2.4.1 Analyse du complexe Impβ/Rev par SEC
Après avoir purifié Rev et Impβ séparément, j’ai essayé de reconstituer le complexe
formé par ces deux protéines. La Figure 2.11 (a) montre une expérience de gel
filtration à une échelle analytique en chargeant Impβseul, Rev seule, ou un mélange
des deux protéines sur une colonne superdex S200. RevV16D/I55N et Impβéluent à un
volume de 2.2 et 1.9 ml, respectivement, tandis que le complexe formé entre Impβet
un excès de RevV16D/I55N donne un pic à 1.7 ml, ce qui indique une espèce moléculaire
dont le rayon hydrodynamique est supérieur à celui d’Impβ. Un deuxième pic à 2.2 ml
correspond à l’excés de RevV16D/I55N non lié. L’analyse par gel dénaturant a confirmé
la présence des deux protéines dans le premier pic (Figure 2.11 (b)). À la différence
de mes tentatives de co-expression (Figure 2.1 (b)), l’intensité des deux bandes
suggère la formation d’un complexe stoechiométrique. La stabilité du complexe a été
confirmée par un gel natif, qui montre une seule bande correspondant au premier
pic (Figure 2.11 (c)). Ces résultats confirment que la reconstitution du complexe à
partir d’Impβet Rev séparément purifiés est une stratégie efficace. De cette manière,
nous avons pu vérifier qu’Impβ et Rev formait un complexe stable.
2.4.2 Analyse du complexe Impβ/Rev par SEC/MALLS
Impβ seule ou en complexe avec un excès/défaut de RevV16D/I55N a été étudié par
des expériences de SEC/MALLS. Les résultats sont représentés dans la Figure
2.12. Nous pouvons voir que lorsqu’Impβest seule, la protéine est à 96% sous forme
monomérique avec une masse moléculaire observée de 95 kDa. La forme dimèrique
représente le 4% restant avec une masse moléculaire observée de 178 kDa. Ces valeurs
se rapprochent des valeurs théoriques attendues (c’est-à-dire 97 kDa pour la forme
monomérique et 194 kDa pour la forme dimérique).
Pour les complexes, lorsque Rev est en excès par rapport à Impβ, la masse molaire
observée par la technique de SEC/MALLS est de 105 kDa. Dans le cas d’un complexe
avec un ratio 1 : 1 ; la masse molaire théorique attendue est de 110 kDa. Lorsqu’Impβ
CHAPITRE 2. RÉSULTATS
2.4. REV ET IMPβ FORMENT UN COMPLEXE STABLE
(a) Chromatogrammes de GF (b) Gels SDS (c) Gels natifs
Figure 2.11 – Gel filtration de Rev et d’Impβ (a) Superposition des
chromato-grammes obtenus sur colonne S200 15 150 GL. Il s’agit des chromatochromato-grammes d’Impβ
seule (en bleu), de RevV16D/I55N seul (en rouge) et du complexe préparé en utilisant
un large excès de Rev (en vert). Les différentes fractions collectées et analysées sont
mises en évidence sous les chromatogrammes. (b) Gels dénaturants (15 % acrylamide)
obtenus pour ces différentes purifications. Le code couleur est le même que
précédem-ment. Les fractions sont indiquées au-dessus des gels. Les gels contiennent également
des marqueurs de poids moléculaire (L). (c) Gels natifs TGX (10% acrylamide) obtenus
pour Impβ seule ou en présence d’un large excès de Rev. Le point isoélectrique de Rev
étant très basique, la protéine seule ne migre pas dans les gels natifs TGX 10%, c’est la
raison pour laquelle on n’observe pas l’excès de Rev sur gel natif. La migration d’Impβ
CHAPITRE 2. RÉSULTATS
2.4. REV ET IMPβ FORMENT UN COMPLEXE STABLE
Figure2.12 – SEC/MALLS d’Impβ seule ou en complexe.Les profils d’élution
suivi à 280 nm ainsi que les distributions de masse molaire calculée par MALLS sont
superposées pour différents échantillons (Impβ seule ou en complexe avec RevV16D/I55N
en défaut ou en excès). L’excès de Rev n’est pas visible sur ce profil à cause de son faible
coefficient d’extinction molaire par rapport à celui d’Impβ.
est en excès, nous observons un épaulement du pic à faible volume d’élution (11.8
ml) correspondant au complexe Impβ/Rev, ainsi que le pic correspondant à Impβ
seule (12.9 ml). La distribution de masse observée pour le complexe indique une
stœchiométrie du complexe relativement bien définie.
2.4.3 Visualisation du complexe Impβ/Rev par microscopie
électronique
L’apparence monodisperse du complexe observé par SEC/MALLS contraste avec la
tendance de Rev à former des fibres. Cette différence a pu être visualisée de
ma-nière frappante par microscopie électronique (ME) à coloration négative. L’avantage
de cette technique est qu’elle donne une indication sur le degré d’homogénéité de
CHAPITRE 2. RÉSULTATS
2.4. REV ET IMPβ FORMENT UN COMPLEXE STABLE
l’échantillon, que ce soit en terme de distribution d’état oligomérique ou
d’homogé-néité conformationnelle des particules. Nous avons examiné les échantillons d’Impβ
et de RevW T obtenus après l’étape finale de purification, ainsi qu’un échantillon du
complexe Impβ/Rev purifié par gel filtration sur une colonne Superdex S200. Toutes
les analyses de ME ont été réalisées par Francesca Coscia, étudiante en thèse au sein
de notre équipe.
Impβ seule était difficilement visible sur les micrographes, le signal que nous voyons
correspondait principalement à du bruit de fond (cf. Annexe F, page 198). En
re-vanche, les micrographes de RevW T seul ou en complexe ont donné des résultats
intéressants (Figure 2.13). Rev présente une distribution de particules de diff
é-rentes tailles, y compris des formes arrondies inférieures à 10 nm de diamètre, des
particules plus grosses (15-20 nm) en forme de "C", et des microfibres mesurant
approximativement 15 nM en largeur et jusqu’à 150 nm en longueur,
vraisemblable-ment formés par plusieurs unités en forme de "C" qui s’enchaînent. Ces observations
sont en accord avec nos données de gel filtration et de SEC/MALLS qui montrent
que RevW T a tendance à s’agréger et sont également en accord avec des publications
montrant que Rev est capable de former des fibres en solution (Havlin et al., 2007 ;
Daugherty et al., 2010a).
De façon frappante, lorsque RevW T est complexé à Impβ, nous observons une
dispa-rition de cet état d’agrégation (Figure 2.13 (b) et (d)). À la place des fibres, on
observe des particules d’un diamètre d’environ 5 nm, comparables aux dimensions
de la structure cristalline d’Impβ en complexe avec l’IBB d’Impα (à peu près 80
Å x 60 Å x 50 Å). L’homogénéité de ces particules nous a encouragé à poursuivre
l’étude structurale du complexe Impβ/Rev.
CHAPITRE 2. RÉSULTATS
Dans le document
Etude de l'interaction entre la protéine humaine Importin beta et la protéine du VIH-1 Rev
(Page 67-71)