Purification d’Importin α et préparation de la colonne d’a ffi nité134

d’a_ffinité

Afin de préparer la résine de Sepharose réticulée avec Impα, il fallait d’abord purifier

cette protéine. La construction exprimant Impα disponible au laboratoire contient

une étiquette histidine et sa purification s’effectue en réalisant trois étapes de

chro-matographies différentes (Figure 4.3).

12 litres de cultures ont été préparés. L’incubation à 37○ des cellules a été e_ffectuée

jusqu’à ce que l’absorbance à 600 nm atteigne 0.5, ensuite l’induction de l’expression

protéique a été réalisée en ajoutant 0.5 mM d’IPTG. La culture a continué à 20○C

sur la nuit. Enfin, les cellules ont été centrifugées à 7550 g pendant 10 min.

Le culot bactérien a été resuspendu dans 125 ml de tampon de lyse (20 mM HEPES

pH 7.5, 600 mM NaCl, 10% glycérol, 10 mM imidazole pH 8.0, 1 mM EDTA, 1 mM

PMSF, 5 mMβ-mercaptoéthanol, une tablette d’anti-protéases (Roche)). Une étape

de sonication a été réalisée pour lyser les cellules et l’échantillon a été clarifié par

centrifugation (40000 g pendant 30 min à 4○C). Le lysat soluble a été ensuite injecté

à travers 5 colonnes en série de 5 ml contenant une résine Ni-NTA

(MACHEREY-NAGEL) équilibrée dans le tampon de lyse. Ce dernier ne contenait pas de tablettes

d’anti-protéases.

Ensuite 75 ml de tampon de lavage (50 mM HEPES pH 7.5, 1 M KCl, 500 mM

MgCl2, 25 mM imidazole pH 8.0, 5 mM β-mercaptoéthanol ; Figure 4.3 (a)) suivi

de 50 ml de tampon de lyse ont été injectés. Finalement, un gradient de 0% à 70%

de tampon d’élution (50 mM HEPES pH 7.5, 300 mM NaCl, 10% glycérol, 300

CHAPITRE 4. MATÉRIELS ET MÉTHODES

4.2. PRODUCTION ET PURIFICATION DES PROTÉINES

mM imidazole pH 8.0, 5 mM β-mercaptoéthanol) a été réalisé sur 8 volumes de

colonne (200 ml) suivi de 75 ml de tampon d’élution et des fractions de 5 ml ont été

collectées.

(a) Ni-NTA (b) MonoQ

(c) Gel filtration (d) Couplage

Figure4.3 – Purification d’Impα et couplage sur la résine de Sepharose.Sur

les chromatogrammes, les courbes de l’absorbance détectée à 280 nm sont

représen-tées en bleu, les courbes de conductivité en rose et le gradient du tampon d’élution est

indiqué en vert. Les fractions analysées sur gel dénaturant (12% acrylamide) sont

indi-quées par des cercles colorés. (a) Impαpurifiée par chromatographie d’a_ffinité Ni-NTA.

Chromatogramme et gel dénaturant (12% acrylamide). (b) Impα purifiée par une étape

d’échangeuse d’anion (MonoQ) après Ni-NTA. (c) Gel filtration (Superdex S75 10/300)

d’Impα. (d) Efficacité du couplage d’Impα sur la résine de sepharose visualisée par gel

dénaturant.

Les fractions contenant Importin α ont été mises ensemble et une dialyse contre 4

litres de tampon (20 mM HEPES pH 7.5, 50 mM NaCl, 5 mMβ-mercaptoéthanol) a

été réalisée pendant la nuit à 4○C . La solution a été ensuite passée dans 3 colonnes

CHAPITRE 4. MATÉRIELS ET MÉTHODES

4.2. PRODUCTION ET PURIFICATION DES PROTÉINES

contenant de la résine échangeuse d’anion (HiTrap MonoQ HP de 5 ml, GE

Heal-thcare Life Science,Figure 4.3 (b)) équilibrée avec du tampon de dialyse. Afin de

nettoyer la résine, 45 ml de tampon de dialyse ont été ajoutés. Enfin l’élution a été

réalisée à l’aide d’un gradient de 0% à 100% de tampon d’élution (20 mM HEPES

pH 7.5, 600 mM NaCl, 5 mM β-mercaptoéthanol) sur 15 volumes de colonne (225

ml). Ensuite il a été ajouté 60 ml de tampon d’élution. Le débit a été de 5 ml/min

et des fractions de 5 ml ont été collectées.

Les fractions contenant Importinα ont été concentrées jusqu’à un volume

approxi-matif de 500 µl. Enfin une étape de gel filtration (Superdex S75 10/300 GL, GE

Healthcare Life Science, Figure 4.3 (c)) a été réalisée à l’aide de deux injections

de 250µl.

Une résine de Sepharose activée par du bromure de cyanogène a été utilisée pour

immobiliser Impα(CNBr-activated Sepharose 4B, GE Healthcare Life Science). Les

solutions contenant Impα avant et après réaction ont été analysées à l’aide d’un

gel dénaturant (Figure 4.3 (d)). Après couplage il ne reste plus de protéine en

solution, suggérant que le couplage a été éfficace et que la totalité d’Impα a été

réticulée sur la matrice.

4.2.3 Purification d’Importin β

Historiquement, Importin β était purifiée au sein du laboratoire à l’aide d’une

co-lonne d’affinité contenant une résine de sepharose où Importin αétait immobilisée.

Le processus de purification étant inefficace, j’ai choisi de rajouter une étiquette

poly-histidine qui peut être ôtée en ajoutant également un site de clivage à la

pro-téase TEV (cf. 4.1.1, page 128).

Protocole 1 :

Purification historique à l’aide d’Importin α

Deux litres de milieu LB/Ampicilline ont été ensemencés par une préculture de

cellules BL21(DE3) contenant le plasmide pQE60 ayant comme insert la protéine

CHAPITRE 4. MATÉRIELS ET MÉTHODES

4.2. PRODUCTION ET PURIFICATION DES PROTÉINES

humaine Importinβ. La culture a été réalisée à 37○C. La production de protéine a été

induite en ajoutant 0.5 mM d’IPTG lorsque la densité optique à 600 nm était de 0.5.

La culture a été poursuivie pendant 5 h à 30○C puis les cellules ont été centrifugées

10 min à 7550 g. Lors des tests d’expression une incubation après induction de 18h

à 16○C et une autre de 3h30 à 37○C ont été testées.

35 ml de tampon de lyse (20 mM HEPES pH 7.5, 600 mM NaCl, 1 mM EDTA,

1 mM PMSF, 5 mMβ-mercaptoéthanol, une tablette d’anti-protéases [Roche]) ont

été utilisés afin de resuspendre le culot bactérien, puis une étape de sonication a

été réalisée pour lyser les cellules. Pour obtenir les protéines solubles, le lysat a

été centrifugé à 40000 g pendant 30 min à 4○C. Le surnageant a subi une étape

de précipitation au sulfate d’ammonium (45% de saturation puis centrifugation à

3500 g pendant 30 min à 4○C). Le culot a été resolubilisé dans 50 ml de tampon

de resolubilisation (20 mM HEPES pH 7.5, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, 5 mM β

-mercaptoéthanol) et chargé dans une colonne par gravité contenant 3.5 ml de résine

couplée à Importin α équilibrée à l’aide du tampon de lavage (20 mM HEPES pH

7.5, 150 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 5 mM β-mercaptoéthanol, 1 mM EDTA, 1 mM

PMSF, une tablette d’anti-protéases (Roche)).

Ensuite, 5 ml de tampon de lavage ont été appliqués et finalement l’élution a été

réalisée en rajoutant 2 fois 3.5 ml de tampon d’élution (20 mM HEPES pH 7.5,

150 mM NaCl, 500 mM MgCl2, 5 mM β-mercaptoéthanol, 1 mM EDTA, 1 mM

PMSF, une tablette d’anti-protéases (Roche)). L’interaction étant électrostatique,

le chlorure de magnésium est responsable de cette élution. 10 cycles ont été effectués

afin de récupérer le maximum de protéines (équilibration, passage d’Impβ, élution).

Les fractions ainsi éluées ont été mélangées et dialysées sur la nuit à 4○C contre 5

litres de tampon A (20 mM HEPES pH 7.5, 50 mM NaCl, 5 mMβ-mercaptoéthanol,

1 mM EDTA, 1 mM PMSF). Le lendemain, le boudin de dialyse a été placé encore

3 h à 4○C dans 5 litres de tampon A frais.

Les protéines ont été concentrées jusqu’à un volume de 5 ml en utilisant un Centricon

ayant un seuil de coupure de 50 kDa. Ensuite l’échantillon a été appliqué à 5 ml

de résine échangeuse d’anions (HiTrap MonoQ HP, GE Healthcare Life Science)

équilibrée avec le tampon A. Un nettoyage utilisant 6 ml de tampon A a été e_ffectué

et ensuite l’élution a été réalisée par un gradient sur 20 ml de 0% à 100% de tampon

CHAPITRE 4. MATÉRIELS ET MÉTHODES

4.2. PRODUCTION ET PURIFICATION DES PROTÉINES

B (même tampon que A avec 1 M NaCl). Ensuite 6 ml de tampon B ont été injectés.

Des fractions de 500 µl ont été collectées lors de cette étape de purification et le

débit était de 5 ml/min, ce qui correspond au débit maximal recommandé.

Les fractions contenant Importinβ ont été concentrées jusqu’à un volume

approxi-matif de 1 ml et l’échantillon a été passé sur une colonne de gel filtration (HiLoad

Superdex S200 10/300, GE Healthcare Life Science) équilibrée dans le tampon de

cristallogenèse (20 mM HEPES pH 7.5, 200 mM NaCl, 1 mM DTT). La

concentra-tion protéique a été déterminée par densité optique à 280 nm (DO280) et à l’aide

du coe_fficient d’extinction molaire déterminé par comparaison entre le lien de cette

densité optique et la quantification des acides aminés (cf. 4.6, page 144).

Protocole 2 :

Purification d’Impβ contenant une étiquette histidine

Les cellules BL21(DE3) qui ont été utilisées possèdent un plasmide pMMIP2

(dé-rivé de pETM11, cf. 4.1.1, page 128). Ce dernier possède entre autres un gène de

résistance à la kanamycine et un gène codant pour une protéine de fusion contenant

une étiquette histidine, un site de clivage à la TEV et la protéine humaine Importin

β. Ces cellules ont été cultivées sous forme de préculture à 37○C dans un milieu

LB/Kanamycine et ont été utilisées le lendemain afin d’ensemencer 12 litres de

mi-lieu frais. La culture a été réalisée à 37○C jusqu’au moment où la valeur de laDO600

était de 0.6. Ensuite, l’induction de l’expression de la protéine de fusion d’intérêt a

été réalisée par l’ajout de 0,5 mM d’IPTG et la culture a été poursuivie pendant 5

h supplémentaires à 30○C.

Les bactéries après culture ont été centrifugées pendant 10 min à 7550 g et

resuspen-dues dans 100 ml de tampon de lyse (50 mM HEPES pH 7.5, 300 mM NaCl, 1 mM

EDTA, 0.1 mM PMSF, 5 mMβ-mercaptoéthanol, 25 mM imidazole pH 8.0, 5 mM

MgCl2, 10% glycérol, une tablette d’anti-protéases (Roche)). Les cellules ont été

ly-sées par sonication et les agrégats insolubles du lysat ont été clarifiés en centrifugeant

l’échantillon à 40000 g pendant 30 min à 4○C. Le lysat ainsi clarifié a été ensuite

injecté à travers 5 colonnes de 5 ml mises en série contenant une résine Ni-NTA

(MACHEREY-NAGEL) équilibrée dans du tampon de lyse. 75 ml de tampon de

CHAPITRE 4. MATÉRIELS ET MÉTHODES

4.2. PRODUCTION ET PURIFICATION DES PROTÉINES

lavage (50 mM HEPES pH 7.5, 1 M KCl, 500 mMMgCl2, 25 mM imidazole pH 8.0,

5 mM β-mercaptoéthanol, 1 mM EDTA, 0.1 mM PMSF) ont été ensuite injectés.

Finalement un gradient de 250 ml de 0% à 70% de tampon d’élution (50 mM HEPES

pH 7.5, 300 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.1 mM PMSF, 5 mMβ-mercaptoéthanol, 300

mM imidazole pH 8.0, 5 mMMgCl2, 10% glycérol) a été réalisé, et des fractions de

5 ml ont été collectées.

Les fractions contenant Importin β ont été rassemblées, incubées avec 22,5 ml de

protéase TEV de pureté supérieure à 99% (cf. 4.2.1, page 132). La solution protéique

a été insérée dans un boudin de dialyse (12-14 kDa de seuil de coupure) et dialysée

sur la nuit à 4○C contre le tampon de dialyse (50 mM HEPES pH 7.5, 300 mM NaCl,

5 mMβ-mercaptoéthanol). La solution de protéines a à nouveau été passée sur les

mêmes colonnes contenant de la résine Ni-NTA pré-équilibrées dans le tampon de

dialyse et 50 ml de tampon de dialyse ont été rajoutés afin d’obtenir la fraction

filtrat ("Flow-through").

Ensuite le filtrat contenant Importin β sans étiquette histidine a été concentré (50

kDa Amicon, Millipore) jusqu’à atteindre un volume de 5 ml. L’échantillon a été

séparé en deux fois 2.5 ml, centrifugé à 16000 g pendant 10 min et injecté sur une

colonne de gel filtration (HiLoad Superdex S200 16/60 Prep grad, GE Healthcare

Life Science) équilibrée dans un tampon de stockage (40 mM Tris-HCl pH 8.0, 200

mM NaCl, 1 mM DTT). Le volume de la boucle était d’une capacité de 5 ml.

Dans le document Etude de l'interaction entre la protéine humaine Importin beta et la protéine du VIH-1 Rev (Page 148-153)