Paramètres déterminés indépendamment d’un modèle atomique 96

Nous avons ensuite décidé d’étudier le complexe Impβ/Rev par diffusion des rayons

X aux petits angles (SAXS). Cette technique donne des informations utiles sur

la taille et la forme tridimensionnelle des macromolécules en solution, mais à une

résolution bien inférieure à celle qu’on peut obtenir par la cristallographie (pour

re-vue : Petoukhov et al., 2012 ; Mertens and Svergun, 2010). Avec la ligne de lumière

BM29 du synchrotron de l’ESRF, il est possible de mesurer des données SAXS sur

un échantillon en sortie d’une colonne de gel filtration. Cette configuration permet

d’améliorer la qualité des données en réduisant le nombre d’espèces moléculaires

contribuant au spectre de diffusion. Nous avons utilisé cette configuration pour

col-lecter des données SAXS sur la protéine Impβ, seule ou en complexe avec RevV16D,

RevV16D/I55N, ou Rev4−69V16D/I55N. Ces données ont été collectées avec l’aide de

Marjolaine Noirclerc de notre équipe, et analysées avec l’aide d’un collègue de notre

institut, Frank Gabel, expert dans l’interprétation des données SAXS. Pour chaque

CHAPITRE 2. RÉSULTATS

2.13. ANALYSE DU COMPLEXE IMPβ/REV PAR SAXS

échantillon, l’analyse des données nous a permis de calculer le rayon de giration

(Rg) et la distance interatomique maximale (Dmax;Tableau 2.7 (a)) et de tracer

la distribution des distances interatomiques (Figure 2.36 (a)). Pour comparaison,

nous avons également déterminé les valeurs de ces paramètres à partir des structures

cristallines connues d’Impβ (Tableau 2.7 (b) et Figure 2.36 (b)).

TABLEAU 2.7 – Dimensions moléculaires d’Impβ. A. Valeurs de rayon de giration

(Rg) et distance interatomique maximale (Dmax) déterminées par SAXS.

B. Valeurs de Rg etDmax calculées pour les structures cristallines connues. Seulement

les structures contenant Impβ entière ont été considérées.

1 stœchiométrie attendue selon nos analyses biochimiques et biophysiques.

2 Pour les références, voir Tableau 1.3

3 Sauf indication contraire Impβ signifie la protéine humaine. Sc = Saccharomyces

ce-revisaie, Mm =Mus musculus.

4 Les valeurs de Rg et Dmax ont été calculées avec le logiciel Moleman2

(http ://xray.bmc.uu.se/usf).

Pour la protéine Impβ isolée, les valeurs de Rg (37 Å ) et de Dmax (125 Å ) sont

plus importantes que celles calculées à partir des structures cristallines connues (Rg

CHAPITRE 2. RÉSULTATS

2.13. ANALYSE DU COMPLEXE IMPβ/REV PAR SAXS

Figure 2.36 – Distribution des distances interatomiques. Les distributions ont

été normalisées pour que l’aire sous la courbe soit égale à 1. (a) Distributions calculées

à partir des données SAXS. (b) Distributions calculées à partir des structures cristallines

d’Impβ en complexe avec trois cargos di_fférents, Impα-IBB (jaune), SREBP-2 (vert

clair) et Snail1 (vert foncé). La courbe calculée pour le complexe Impβ

/Snurportin1-IBB (PDB ID 2PBQ) n’est pas représentée, étant quasiment identique à celle du

com-plexe Impβ/Impα-IBB. Pour comparaison, la distribution observée pour le complexe

Impβ/Rev4−69V16D/I55N est représentée en rouge.

CHAPITRE 2. RÉSULTATS

2.13. ANALYSE DU COMPLEXE IMPβ/REV PAR SAXS

= 30.6 - 36.7 Å ; Dmax = 90 - 112 Å ; Tableau 2.7 (a) et (b)). Cette différence

est probablement due aux partenaires (Ran, cargo, Nups) présents dans la plupart

des structures, ainsi qu’aux e_ffets d’empilement cristallin, qui stabilisent une forme

plus compacte des répétitions HEAT. En e_ffet, une étude de SAXS a préalablement

montré que les protéines Impβ isolées de levure et de souris adoptent des

confor-mations assez étendues en solution (Rg de 39 et 45 Å et Dmax de 120 et 145 Å ,

respectivement ; Forwood et al., 2010).

La fixation de RevV16D à Impβ augmente à la fois la valeur de Rg (jusqu’à 42.5

Å ) et celle de D_max (jusqu’à 155 Å ; Tableau 2.7, Exp. 1 et 2). L’importante

augmentation de D_max pourrait être attribuée à une stabilisation d’Impβ dans une

conformation étendue, ou à la présence de la queue C-terminale de Rev, qui occupe

très probablement une position périphérique dans le complexe (ex. Figure 2.35).

De façon intéressante, le complexe Impβ/RevV16D/I55N, dont la stœchiométrie est

de 1 : 2 (selon nos données biophysiques), présente des valeurs plus petites de Rg

(40.1 Å ) et de Dmax (135 Å ; Tableau 2.7 (a), Exp. 2 et 3). Le deuxième

mo-nomère de Rev semblerait donc stabiliser une conformation plus compacte d’Impβ

et/ou empêcher la queue C-terminale de Rev d’être si étendue. Comme attendu, le

complexe impliquant le mutant de Rev sans queue C-terminale, Rev4−69V16D/I55N,

est plus compact que celui comprenant le mutant entier (Tableau 2.7 (a), Exp. 3

et 4). Pour les trois complexes d’Impβavec Rev que nous avons étudiés, les valeurs

deRg et deDmaxsont nettement supérieures à celles des complexes d’Impβ dont les

structures sont connues (R_g = 30.3 - 34.6 Å ;D_max= 90 - 112 Å ;Tableau 2.7 (b)).

Parmi les quatre structures connues d’Impβlié à un cargo, celle qui ressemble le plus

aux complexes d’Impβ/Rev est celle qui est la plus étendue (selon la valeur deRg),

à savoir Impβ/Snail1 (Choi et al., 2014). En effet, laFigure 2.36 (b) montre que

ce complexe présente une distribution de distances interatomiques assez proche à

celle d’Impβ/RevV16D/I55N, ce qui suggère qu’Impβ liée à Rev pourrait adopter une

conformation similaire à Impβ liée à Snail1, c’est-à-dire, plutôt étendue.

CHAPITRE 2. RÉSULTATS

2.13. ANALYSE DU COMPLEXE IMPβ/REV PAR SAXS

2.13.2 Modèles à billes calculées ab initio

Nous avons ensuite calculé des modèles tridimensionnels ab initio à partir des quatre

jeux de données SAXS. Des modèles représentatifs de chaque jeu de données sont

pré-sentés dans laFigure 2.37. Ces modèles ne sont pas uniques, puisque plusieurs

mo-dèles sont compatibles avec la même courbe de diffusion. Néanmoins, ils présentent

des caractéristiques qui confirment les tendances décrites ci-dessus. Comme le montre

laFigure 2.37, les quatre structures présentent plus ou moins la même taille et la

même forme. Cependant, en accord avec les valeurs calculées de Dmax, nous

remar-quons que le volume (tel qu’indiqué par le nombre de billes) est plus grand pour le

complexe Impβ/RevV16D, principalement à cause d’un lobe supplémentaire qui

aug-mente la hauteur modèle de 30-40 Å par rapport aux autres complexes (Tableau

2.7 (a)). Les modèles à billes d’Impβseule et en complexe avec RevV16D/I55N sont de

taille et de forme similaires, alors que le modèle d’Impβ/Rev4−69V16D/I55N est

consi-dérablement plus petit, en accord avec la délétion des résidus 70-116 de Rev.

Pour avoir une meilleure idée de la forme tridimensionnelle de ces modèles, nous

avons comparé le modèle ab initio d’Impβ/RevV16D avec un modèle atomique

hypo-thétique du complexe obtenu par HADDOCK (appartenant au Cluster 1 ; Figure

2.38). Nous avons d’abord modélisé la queue C-terminale de Rev dans une

conforma-tion arbitraire ("mi-étendue", décrite plus bas). Dans ce cas, nous pouvons observer

qu’une bonne partie du modèle atomique obtenu est en adéquation avec le modèle à

billes, à l’exception de la queue C-terminale de Rev et de deux répétitions HEAT

N-terminales d’Impβ. Comme le montre laFigure 2.38; flèches en cyan et magenta),

une conformation plus étendue du solénoïde HEAT et une réorientation de la queue

C-terminale de Rev permettrait d’obtenir une meilleure correspondance avec le

mo-dèle ab initio. Ce résultat nous a encouragé à analyser les données SAXS de façon

plus poussée, dans le but d’identifier la configuration du complexe Impβ/Rev la plus

convaincante.

CHAPITRE 2. RÉSULTATS

2.13. ANALYSE DU COMPLEXE IMPβ/REV PAR SAXS

Figure 2.37 – Modèles des complexes Impβ/Rev calculés ab initio à partir

des données SAXS. Les modèles ont été calculés avec DAMMIF et alignés avec

CHAPITRE 2. RÉSULTATS

2.13. ANALYSE DU COMPLEXE IMPβ/REV PAR SAXS

Figure2.38 – Comparaison du modèle ab initio du complexe Impβ/RevV16D

avec une structure hypothétique du complexe obtenue par amarrage

molécu-laire.Les coordonnées d’une des configurations calculées par HADDOCK (appartenant

au Cluster 1) ont été alignées avec le modèle à billes par le logiciel Supcomb du progiciel

ATSAS (Petoukhov et al., 2012). Les deux régions indiquées par les astérisques en cyan

et magenta pourraient correspondre aux répétitions HEAT N-terminales d’Impβ et à la

queue C-terminale de Rev, respectivement.

CHAPITRE 2. RÉSULTATS

2.13. ANALYSE DU COMPLEXE IMPβ/REV PAR SAXS

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