2 Analyse de la charge virale à 7 dpi
1. Réponse phénotypique de la population française TOU-A au TuMV
La réponse à l’infection par le TuMV des différentes accessions d’A. thaliana issues de la population française TOU a été caractérisée à partir de six traits phénotypiques liés à la maladie et à la production de biomasse. Ainsi, les traits phénotypiques analysés lors de cet essai concernent :
la charge virale mesurée par ELISA semi-quantitatif. Elle correspond de ce fait à une valeur moyenne de la densité optique mesurée à 405 nm pour chacun des échantillons de chaque accession
la fréquence d’infection en lien avec la charge virale (notée Fc_charge virale). Elle correspond au nombre d’échantillons/accession présentant une DO positive en ELISA sur le nombre total d’échantillons/accession
la symptomatologie en lien avec la notation de symptômes sur la base d’une échelle de notation allant de 0, absence de symptômes à 4, symptômes sévères caractérisés par de fortes jaunisses, desséchement et une forte réduction de la croissance
la fréquence d’infection en lien avec les symptômes (notée Fc_Symptômes). Elle correspond au nombre d’échantillons/accession présentant des symptômes sur le nombre total d’échantillons/accession.
la hauteur des hampes qui a été normalisée par des échantillons inoculés à blanc (mock-inoculés) pour chacune des accessions analysées. Cette normalisation permet de prendre en compte la variabilité liée au génotype en ne considérant que la variation phénotypique en lien avec l’infection virale.
la biomasse sèche également normalisée par des échantillons inoculés à blanc (mock-inoculés) pour chacune des accessions étudiés.
L’ensemble de ces traits phénotypiques ont été transformés en utilisant la fonction log. L’ensemble de ces variables ont été choisies car elles ont été montrées comme associées à la réponse à la maladie notamment en conditions contrôlées (données chambre de culture non présentées).
La charge virale moyenne sur l’ensemble de la population TOU-A a été estimée par DAS ELISA à une valeur de 0.445 (DO 405 nm). Cette valeur moyenne est supérieure aux DO moyennes obtenues sur les accessions de la population mondiale testées en 2013 (0.249) et en 2014 (0.148) (Rubio et al., 2017 – submitted). La quantification de la charge virale de l’inoculum mesurée par Q-PCR est 1.2 fois et 1.4 fois supérieure à celle estimée sur les inocula des essais extérieurs de 2013 et 2014 respectivement (Rubio et al., 2017 – submitted). Par rapport aux accessions de la population mondiale testées en 2013 et 2014, 27 accessions font partie de la population TOU-A1. Deux types de comportements sont observés en fonction des trois années d’étude : i) 23 accessions qui sont sensibles au TuMV sur les trois essais (en bleu Tab. A3.A1) et ii) 4 accessions dont la réponse au TuMV varie en fonction des essais. Il s’agit d’accessions qui en 2013 et 2014 semblaient être résistantes mais qui en 2016 présentent une fréquence d’infection en lien avec la charge virale allant de 44% à 78% (en violet Tab. A3.A1).
La distribution de ces différents traits phénotypiques montre qu’il existe une variabilité de réponse notamment en ce qui concerne la charge virale (Fig. A3.1a), les symptômes (Fig.
A3.1c) et la biomasse sèche (Fig. A3.1f). La distribution de la longueur des hampes est marquée par un nombre important d’échantillons ne présentant pas de hampes. En effet, près de la moitié des génotypes (93/191 soit 48.7 % de génotypes de la population) ne présentait pas de hampes au moment du prélèvement (flèche orange Fig. A3.1e). De même, la fréquence d’infection basée sur la charge virale montre qu’un très faible nombre d’échantillons (< 10%) n’accumule pas de virus au sein de cette population (flèche rose Fig. A3.1b.).
Les données relatives à la hauteur des hampes et à la biomasse sèche ont été comparées entre échantillons inoculés par le virus et ceux mock-inoculés. Ainsi, il n’existe pas de différences significatives dans la hauteur des hampes entre échantillons inoculés et mock-inoculés (Fig. A3.A1). En revanche, une différence significative a été mise en évidence sur la biomasse sèche (Fig. A3.A1). Cela montre l’effet de l’infection sur la biomasse des plantes. En ce qui concerne la hauteur des hampes, ce trait phénotypique semble être moins clairement associé à l’infection. Cela pourrait s’expliquer par les particularités de réponse déjà observées lors des essais extérieurs réalisés sur la population mondiale (Rubio et al., 2017 – submitted). En effet, le phénotype est très différent par rapport aux conditions contrôlées. Par exemple, les notations de symptômes sont beaucoup plus complexes à réaliser ce qui amène le plus souvent à sous-estimer la maladie. La hauteur des hampes serait donc un autre trait phénotypique sur lequel les conditions environnementales semblent avoir un effet important. Le lien entre les différentes variables caractérisées a été testé dans une analyse des corrélations (Fig. A3.2a) et est représenté sur le graphique des variables (Fig. A3.2b) où trois
Figure A3.1|Distribution des différents traits phénotypiques mesurés en réponse au TuMV pour la population française TOU-A d’A.thaliana en conditions extérieures
Fréquence des distributions représentée en ordonnée et les différents traits phénotypiques (transformés en utilisant la fonction log) en abscisse : (a) charge virale quantifiée par DAS-ELISA (DO mesurée à 405 nm) (b)
fréquence d’infection en lien avec la charge virale = nombre d’échantillons/accession avec une DO en ELISA positive/nombre total d’échantillons/accession (c) symptômes notés à partir d’une grille de notation allant de 0, aucun symptôme à 4, symptômes très sévères (d) fréquence d’infection en lien avec les symptômes = nombre d’échantillons/accession avec des symptômes/nombre total d’échantillons/accession (e) hauteur des hampes normalisée par les échantillons de chaque génotype non infectés (f) biomasse sèche normalisée par les échantillons de chaque génotype non infectés
groupes de variables peuvent être décrits i) le groupe comprenant les données en relation avec la charge virale (en bleu), ii) le groupe comprenant les données de symptômes (en vert) et iii) le groupe comprenant les données de hauteur de hampe et de biomasse sèche. L’indépendance entre les données de charge virale et la symptomatologie est très surprenante (Fig. A3.2a). La population française TOU-A étant constituée d’accessions échantillonnées à deux périodes différentes (2002 et 2010), des analyses comparatives entre ces deux groupes d’accessions (TOU-A1 et TOU-A6) permettent d’apporter des éléments de réponse à ces observations.
2. Analyse comparative des sous-groupes de la population française TOU-A
Cette population française d’A. thaliana est constituée de deux groupes d’accessions différents : les accessions collectées en 2002 (notées TOU-A1) et celles collectées en 2010 (notées TOU-A6). Chaque accession correspond aux graines collectées sur une plante individuelle selon le protocole d’échantillonnage décrit par Frachon et ses collaborateurs (2017). Les graines ont ensuite été semées en conditions contrôlées afin de diminuer les effets maternels possibles parmi les différentes accessions (Frachon et al., 2017). Le graphique des individus obtenus à partir de l’analyse en composantes principales réalisée à partir de l’ensemble des données phénotypiques ne permet pas de distinguer de façon nette les deux sous-groupes. En revanche, les accessions TOU-A6 semblent être plus regroupées en haut à gauche du graphique alors que les accessions TOU-A1 semblent avoir une répartition plus dispersée. Les ellipses, correspondant à l’intervalle de confiance de l’estimation des coordonnées du barycentre de chaque groupe, se retrouvent côte à côte mais ne se superposent pas (Fig. A3.3). En regardant en parallèle le graphique des variables commenté précédemment (Fig. A3.2b), le regroupement de la sous-population TOU-A6 pourrait être expliqué en particulier par la charge virale. La comparaison des variables entre les accessionsFigure A3.2| Tableau des corrélations (a) et graphique des variables (b) des différents traits phénotypiques mesurés en réponse au TuMV pour la population française TOU-A d’A.thaliana en conditions extérieures
La significativité des coefficients de corrélation de Spearman a été testée (Sign.codes : 0 ‘***’ 0.001 ‘**’ 0.01 ‘*’ 0.05 ‘.’ 0.1). Les relations entre les différentes variables sont représentées dans le graphique des variables (b).
(a)
TOU-A1 et TOU-A6, révèle des différences significatives en ce qui concerne la charge virale, les symptômes, la fréquence d’infection en lien avec les symptômes et la hauteur des hampes (Fig. A3.4). Ainsi, une accumulation virale plus importante est mesurée chez les accessions TOU-A6 alors qu’à l’inverse la sévérité et la fréquence des symptômes sont plus importantes chez les accessions TOU-A1. Cela vient corroborer les résultats précédents sur les corrélations entre les variables où charge virale et symptomatologie étaient indépendantes. Des différences significatives sont également observées avec des hauteurs de hampes plus élevées chez les accessions TOU-A1. Aucune différence significative n’est en revanche associée à la biomasse sèche (Fig. A3.4).
Figure A3.3| Graphique des individus obtenu par l'analyse en composantes principales sur les données phénotypiques mesurées en réponse au TuMV pour la population française TOU-A d’A.thaliana
Les deux sous-populations sont représentées par deux couleurs différentes, bleu clair pour les accessions TOU-A1 et bleu foncé pour les accessions TOU-A6. Les ellipses correspondant à l’intervalle de confiance de l’estimation des coordonnées du barycentre de chaque groupe se retrouvent côte à côte mais ne se superposent pas.
Figure A3.4| Boxplots des différents traits phénotypiques mesurés chez les accessions TOU-A1 et TOU-A6
Les comparaisons entre accessions de la population française TOU-A1 et TOU-A6 ont été effectuées pour l’ensemble des traits phénotypiques analysés. Des analyses statistiques ont été menées (test non-paramétrique de Wilcoxon). Les significativités statistiques sont représentées par des astérisques roses (Signif.codes : 0 ‘***’