Régulation des mécanismes de défenses

2.4.5.1. Cas du régulateur CueR des B. pertussis

Nous avons caractérisé en profondeur la régulation du système bp1727-1728-1729 dans l’article. Néanmoins, malgré nos efforts il manque la caractérisation d’un des acteurs majeurs de ce système : la protéine CueR (BP1726). Sa caractérisation n’a pu être effectuée que par sa délétion, qui a mis en évidence une modification de la régulation de l’opéron. Nous avons tenté de produire une protéine recombinante chez E. coli en utilisant divers plasmides d’expression, mais sans succès. Lors des clonages dans ces vecteurs, même si l’expression du gène recombinant devait être minimal en absence d’induction, plusieurs mutations spontanées apparaissaient, provoquant des sauts de phase ou des codons stop dans le gène. Lorsque nous parvenions à obtenir un plasmide d’expression final, les cultures d’E. coli mouraient lors de l’induction, et celles qui poussaient ne produisaient pas la protéine. En analysant par séquençage les différents plasmides obtenus lors des clonages intermédiaires, nous avons pu observer la récurrence de certaines mutations. En dehors des sauts de phase ou des codons stop la mutation des histidines autour du site de liaison au métal était relativement fréquente.

Les régulateurs de la famille MerR, dont font partie ceux de type CueR, présentent un site de liaison au métal composé de deux cystéines. Le site de sélection du métal (cuivre ou zinc) est lié à la présence d’une Ser ou d’une Cys plus en amont (Ibáñez et al., 2015). Il est possible de voir chez les Bordetelles 3 histidines extrêmement conservées, qui sont absentes dans les autres CueR. Il est donc probable que ces histidines interviennent dans la complexation du cuivre, et peut être confèrent à CueR une affinité accrue. De fait, il s’avère que ce sont justement ces histidines qui étaient remplacées dans nos plasmides par des mutations spontanées.

Figure 57 :Weblogo du site de liaison aux métaux des régulateurs de type MerR. Seuls des régulateurs à cuivre de type CueR, et non pas ceux à zinc, ont été utilisés pour ces logos. A, weblogo obtenu avec les régulateurs CueR de Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Salmonella enterica, Escherichia coli, Cupriavidus metallidurans et Rubrivivax gélatinosus. B, le second weblogo a été réalisé avec les CueR de toutes les espèces du genre Bordetella.

160 La littérature scientifique a mis en évidence l’extrême affinité de CueR au cuivre Cu1+

de l’ordre de 10-21 M(Changela et al., 2003). Serait-il possible que ces histidines augmentent encore l’affinité, à tel point qu’elles rendraient la protéine toxique pour E. coli ? En effet, si l’affinité de CueR est telle qu’elle titre les ions cuivre nécessaires à l’assemblage des cuproprotéines, on s’attendrait à ce que la bactérie qui doit produire la protéine recombinante ne puisse croitre que si elle trouve un moyen de ne pas exprimer le gène ou si elle sélectionne un variant moins affin.

Nous avons contacté le groupe d’Oleg Melnik du CIIL, qui tente de produire CueR par synthèse chimique. Ce travail est en cours.

2.4.5.2. 5’RACE

Nous avons eu recours à la technique du 5’RACE pour identifier le +1 de transcription du gène bp1727. Nous avons également cherché à identifier une potentielle ré-initiation de transcription dans la région intergénique entre bp1727-bp1728.

Dans les deux conditions testées, la faible couverture (faible nombre de ‘reads’) ne permet pas d’identifier clairement un +1 de transcription. Néanmoins, en conditions standard, on observe quelques départs de transcription dans la région intergénique. En conditions d’excès en cuivre, la plupart des reads proviennent du gène précédent. Ces données nous ont fait supposer la présence d’une double régulation des gènes bp1728-1729 :

Figure 58 : Mapping des reads obtenues par séquençage après isolement des transcrits primaires. En haut en conditions normales de cultures et en bas en condition d’excès de cuivre.

161 la régulation traversante due au site de liaison à l’ADN de CueR devant bp1727 et peut être la régulation ancestrale des deux gènes présents avant la récupération de ce système sous la régulation « cuivre ».

Nous avons également cherché le +1 de transcription de bp1726 (cueR). Néanmoins, son faible niveau de transcription n’a pas permis d’obtenir assez de reads pour conclure. Le plus étonnant est que, contrairement à de nombreux organismes, CueR n’est pas autorégulé chez B. pertussis. Si l’on analyse la région intergénique entre bp1726 et bp1727, on peut voir le site de liaison de CueR devant bp1727 mais il en existe un autre très similaire avec un palindrome identique devant bp1726. Néanmoins, la distance séparant les deux moitiés du palindrome n’est que de 4 nucléotides par rapport au 7 habituels. Il est possible que ce motif de liaison ait dégénéré, empêchant l’autorégulation de CueR.

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2.4.5.3. Régulation OxyR

La seconde régulation médiée par OxyR a elle aussi été investiguée dans l’article.

Au cours de nos recherches sur ce régulateur, nous avons pu observer, grâce à des qRT-PCR, qu’il ne semble pas spécifique du peroxyde d’hydrogène. Lors des caractérisations enzymatiques de BP1728, nous avons constaté que cette enzyme dégrade non seulement le peroxyde d’hydrogène mais aussi les peroxydes organiques comme l’hydroperoxide de tert-Butyl. Si l’enzyme régulée par OxyR n’est pas spécifique d’un peroxyde, il est probable que OxyR non plus. La figure 59 nous montre que le peroxyde organique semble même induire une régulation de bp1728 qui est plus forte que celle causée par l' H2O2. Cette différence vient probablement du fait que l’H2O2 n’est pas seulement dégradé par les peroxydases comme BP1728 mais aussi par la catalase qui est inactive sur les peroxydes organiques.

Figure 59 :qRT-PCR sur le gène bp1728. Les histogrammes représentent la variation d’expression comparée à une culture non traitée. Les données sont normalisées grâce au gène de ménage bp3416

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