Mise au point du dosage de cuivre intracellulaire

En collaboration avec le Dr. Gabriel Billon de l’Université de Lille 1, nous avons mis en place un protocole de quantification absolue du cuivre par ICP-AES et ICP-MS. Dans un premier temps nous avons utilisé cette technologie pour établir les concentrations en cuivre présents dans nos différents milieux de cultures.

Nous avons pu voir que le milieu solide BG+sang sur lequel les bactéries sont cultivées avant chaque expérience est relativement riche en cuivre (environ 3 µM). Il est probable que ce milieu permette à la bactérie de faire des « réserves » permettant sa croissance en milieu liquide malgré l’absence de cuivre dû au chélateur. En revanche, le milieu SS semble assez pauvre en cuivre (environ 0,5 µM). Nous avions également rajouté un témoin, un milieu SS supplémenté de 5 mM de cuivre.

Par la suite, nous avons mis au point un protocole de dosage de cuivre intracellulaire. Dans ce protocole les bactéries sont cultivées en milieu liquide dans les différentes conditions à tester puis sont centrifugées et lavées avec une solution contenant de l’EDTA afin d’éliminer les traces de métaux adsorbés sur la face extérieure de la membrane externe. Les cellules sont lysées et les métaux mis en solution grâce à de l’acide nitrique. Les lysats obtenus avec l’acide nitrique sont ensuite analysés par ICP-AES.

Figure 64 : Quantification de cuivre par ICP-AES dans les différents milieux de cultures. BG = Bordet Gengou ; BG+sang = Bordet-Gengou supplémenté avec 10% de sang de mouton défibriné ; SS = Stainer-Scholte ; SS 5mM Cu = milieu Stainer Scholte supplémenté avec 5 mM de CuSO4. Les barres verticales sont des déviations standard.

Figure 65 : Dosage intracellulaire du cuivre par ICP-AES dans différentes conditions de cultures. Le nombre d’atomes de cuivre est rapporté au volume théorique de la bactérie pour obtenir la concentration intracellulaire. Les barres verticales sont des déviations standard.

171 On voit sur la figure 65 que le cuivre s’accumule à forte concentration dans les bactéries cultivées avec 5 mM de Cu. Outre la chélation du cuivre dans le cytoplasme notamment par CopZ et le glutathion, et possiblement dans le périplasme par du glutathion et d’autres systèmes, il est possible que les ions cuivre liés aux groupements chargés négativement des LOS ne soient pas extraits de façon quantitative par le traitement à l’EDTA. On voit aussi que le BCS diminue la concentration intracellulaire en Cu, puisqu’il le chélate dans le milieu. En revanche, la néocuproïne peut traverser les membranes. Le cuivre se retrouve donc dans les bactéries à une concentration similaire à celle mesurée dans les bactéries non traitées, même s’il n’est pas biodisponible.

Nous avons également mesuré la concentration en cuivre de nombreux mutants pour différentes protéines comme l’ATPase CopA, la multicopper oxidase PcoA et son système d’extrusion PcoB, les chaperonnes CopI, CopZ, et CusF, ou encore l’azurine, une cuproprotéine très abondante qui pourrait servir de de réserve de cuivre dans le périplasme. Aucune de ces analyses n’a mis en exergue de différences significatives, quels que soient les conditions de cultures (carence, excès, déplétion du glutathion / cystéines) ou les stades de croissance (début ou milieu de phase exponentielle, phase stationnaire). Le seul mutant présentant une différence a été le mutant de délétion pour le transporteur TonB-dépendant BfrG.

La figure 66 montre que le mutant de délétion de bfrG présente un déficit intracellulaire de cuivre. Néanmoins, cette analyse est à relativiser car il n’a pas été possible de reproduire ces données. En regardant dans les détails les données de cette analyse et en les comparant à d’autres, il semblerait que deux des 5 réplicats faits avec la bactérie sauvage soient anormalement élevés. Il est donc probable que dans nos conditions de culture ce transporteur n’induise pas une différence de concentration en cuivre suffisante pour être mesurée.

Figure 66 :Dosage intracellulaire du cuivre par ICP-AES en conditions de culture normales. Wt correspond à la bactérie sauvage BPSM. Les données de chaque souche contiennent 5 réplicats. Les barres verticales sont des déviations standard.

172 Par conséquent nous avons pris le parti inverse. Il apparait que bfrG est très finement régulé et est fortement réprimé en présence d’un excès de cuivre (voir section régulation). D’après nos connaissances, B. pertussis est soumise à un excès de cuivre dans une unique situation : la phagocytose. Il n’est donc pas impossible de penser que BfrG soit utile lorsque la bactérie est à la surface des épithélia où le cuivre libre se fait rare ; en revanche elle doit être réprimée lors de la phagocytose afin de bloquer l’entrée du cuivre dans la bactérie. Nous avons donc appliqué un excès important de cuivre aux deux bactéries (mutante et sauvage) et mesuré la vitesse d’entrée du cuivre. En toute logique ce dernier devrait rentrer plus lentement dans le cas du mutant.

La figure 67 met en évidence un certain retard d’entrée du cuivre dans la bactérie mutante. Ces données constituent une preuve indirecte du rôle d’importation du cuivre de BfrG. Depuis l’obtention de ces données, la technique de préparation des bactéries pour l’ICP-AES a été retravaillée et améliorée par Gauthier Roy, le doctorant ayant pris la suite de la caractérisation de cette protéine. Il a pu obtenir des résultats similaires.

Il est néanmoins important d’être prudent sur ces données. Il n’y a pas de différence significative même si ces observations sont reproductibles. De plus, on ne peut pas exclure la possibilité que BfrG soit un importateur de fer qui importe accidentellement du cuivre, expliquant sa régulation négative en présence d’un excès de cuivre.

Figure 67 : Dosage du cuivre

intracellulaire au cours d’un stress cuivrique de 1 mM de CuSO4. Les barres verticales sont des déviations standard.

173