Test de survie au cuivre : Les milieux solides classiques pour B. pertussis empêchant l’usage
du cuivre, le test de survie est effectué en milieu Stainer-Scholte. Celui-ci se décline en deux fractions. La fraction A est composée de Na-L-Glutamate (11.84 g/l), L-proline (0.24 g/l), NaCl (2.5 g/l), KH2PO4 (0.5 g/l), MgCl2-6H2O (0.1 g/l), CaCl2-H2O (20mg/l), Tris-base (1.5 g/l), KCl (0.2 g/l), Cyclodextrine (1 g/l), et des casaminoacides (10 g/l). Cette fraction doit être ajustée à pH 7.4 avant d’être autoclavée. La fraction B se compose de L-cystéine (4 g/l), FeSO4-7H2O (1 g/l), acide nicotinique (0.4 g/l), acide ascorbique (40 g/l) et glutathion réduit (15 g/l). La fraction B est sensible à la chaleur et doit être filtrée. Cette fraction doit être diluée dans 100 volumes de fraction A pour constituer le milieu de culture complet SS. Dans le cas des tests de survie au cuivre, une solution stock de sulfate de cuivre est réalisée à une concentration de 62 mM (9.9 g/l) supplémentée avec du Tris-base à 100 mM (10.6 g/l en plus du Tris-base déjà présent dans la Fraction A). Cette solution stock permet de neutraliser l’effet du cuivre sur le pH. Une solution témoin est produite avec la même quantité de Tris base mais sans cuivre. Cette solution témoin doit avoir perdu son pouvoir tampon par ajout d’HCl jusqu’à un pH de 5.5. Les bactéries sont donc cultivées en milieu SS complet sans cuivre, puis à DO 1.5 les bactéries sont exposées à la quantité voulue de cuivre durant 4 heures (temps de division de
B. pertussis) à 37°C sous agitation. Les bactéries sont ensuite diluées et déposées par 10 µl sur
gélose BG+Sang.
Croissance en excès de cuivre : La croissance en excès de cuivre est réalisée dans du milieu
SS complet supplémenté avec les quantités de cuivre voulues à partir de la solution stock décrite précédemment. Dans le cas de B. pertussis, une concentration de 5 mM entraîne un retard de croissance conséquent sans pâtir des effets délétères du Tris-base à haute concentration.
Croissance en carence en cuivre : La carence peut être réalisée en milieu Thijs (milieu moins
riche) et en SS. Dans les deux cas, il est possible d’utiliser du BCS ou de la néocuproine. Ces
deux chélateurs sont spécifiques du cuivre sous forme Cu1+. Les deux milieux contiennent
suffisamment de réducteur pour provoquer la réduction du cuivre et donc sa chélation. Nous avons choisi de réaliser nos tests de croissance en carence en cuivre en milieu SS avec 250 µM de BCS. Le chélateur doit être préparé à une concentration 100X dans la fraction B du milieu.
Impact des sources de soufre : Ce test se fait dans du milieu SS dépourvu de glutathion et/ou
supplémenté avec 0.49 mM de cystéine pour compenser la perte de glutathion.
Analyses transcriptomiques en carence de cuivre : Plusieurs types d’expériences
191 ont été étudiés. Dans le cas du BCS, la concentration utilisée était de 250 µM tandis que dans le cas de la néocuproine c’est une concentration de 50 µM qui a été utilisée. Pour les expériences en microarrays, les cultures ont été arrêtées à DO 1 tandis que pour le RNAseq (fait uniquement avec le BCS) les cultures ont été arrêtées à DO 1.5-1.8. Les extractions d’ARN et la constitution des librairies sont décrites dans les matériels et méthodes de l’article. Précision : dans le cas de la carence toutes les fioles en verre doivent être lavées a l’HCl 0.1 M 12h sous agitation avant l’utilisation de manière à limiter le relargage de métaux par le verre durant la culture. Néanmoins dans le but de standardiser les expériences nous avons eu recours à des flasques en plastique.
Carence sur milieu solide : Tout d’abord les bactéries sont décongelées et cultivées 36 heures
sur boites BG+Sang. Puis elles passent par une étape de préculture de 24h en milieu SS liquide. Ce test a lieu dans du milieu SS solidifié. La fraction A est additionnée de 14 g/l d’agarose à point de fusion bas. La fraction B est supplémentée avec les concentrations voulues de BCS. Cette fraction B doit être ajoutée uniquement lorsque la fraction A, encore liquide, atteint une température inférieure à 40°C. Une fois le mélange homogène, il est possible de le couler dans des boîtes de pétri avant solidification.
Dosage du cuivre intracellulaire : Les bactéries sont cultivées dans différentes conditions.
La DO est mesurée et les cultures sont ajustées à même DO avec du milieu SS. Un volume de 30 ml de culture est centrifugé 15 minutes à 3500 g. Les bactéries du culot sont ensuite resuspendues dans 15 ml de solution de lavage composée de NaCl (120 mM), Tris-base (10 mM), EDTA (100 µM), puis à nouveau centrifugées 15 minutes à 3500g et lavées une deuxième fois avant une dernière centrifugation. Le culot est alors séché à 99°C de 3 à 16 h en fonction du culot. Ce dernier est ensuite repris dans 500 µl d’acide nitrique (65%) puis placé deux heures à 80°C, bouchon fermé (les tubes devront être ouverts sous sorbonne pour dégazer les oxydes d’azote). Une fois le culot complétement dissous, la solution est diluée dans de l’eau milliQ jusqu’à une concentration d’acide nitrique de 2 à 6.5 % (un minimum de 2% est nécessaire pour maintenir les métaux en solution). Les échantillons doivent ensuite être filtrés sur filtre 0.22 µm avant d’être dosés par ICP-AES ou ICP-MS.
Un protocole plus spécifique du cuivre a été développé par Gauthier Roy et moi. Il s’agit de remplacer l’EDTA par 250µM de BCS et 1 mM d’ascorbate dans la solution de lavage. Nous avons également mis en place une solution « Stop » permettant d’arrêter l’incorporation du cuivre par les bactéries instantanément. Elle se compose de BCS 250 mM et d’ascorbate à 1 M. Cette solution est à diluer 100 fois dans le milieu de culture des bactéries.
Test de détection des chalcophores : Le test de détection des chalcophores se base sur la
formation d’un complexe labile entre le chromazurol S et le cuivre. Dans notre cas nous réalisons une solution 10X du complexe contenant 0.5 mM de CuCl2, 0.525 mM de
192 ChromazurolS, 1.05 mM d’HDTMA. La solution 10X est diluée dans une solution d’agarose à 14 g/l en surfusion avant d’être coulée.
Croissance en excès de cuivre sur milieu solide : Ce test est relativement similaire à la
carence en milieu solide, la différence étant que le cuivre est ajouté à la fraction A (car il est insoluble dans la B) à partir de la solution stock décrite précédemment. La fraction B doit être ajoutée à basse température dans le cas d’agar low melting. On peut aussi l’ajouter à la surface de la fraction A solidifiée mais dans ce cas il est nécessaire d’attendre plusieurs heures que les composés diffusent. De plus pour garder le pouvoir réducteur de la solution B, la diffusion doit se faire dans une atmosphère saturée en argon.
5’RACE : Les expériences de 5’race présentent dans les résultats complémentaires ont été
réalisées en suivant le protocole décrit dans l’article.
Test de survie au stress oxydant induit par la xanthine oxidase : Le test décrit dans les
résultats complémentaires est similaire à celui décrit dans l’article. Les seules différences sont dans les concentrations d’enzymes qui sont notés sur les graphiques et les milieux dans lequels on a réalisé le test.
Test de quantification des ROS intracellulaires : Les bactéries sont décongelées et cultivées
36 heures sur boîtes BG+Sang. Puis elles passent par une étape de préculture de 24h en milieu SS suivie d’une culture de 12h toujours en milieu SS. Une fois la DO désirée atteinte on ajoute 30 µg/ml de Dichlorofluorescine diacetate durant 30 minutes au milieu de culture. Les bactéries sont ensuite lavées et resuspendues dans du SS (uniquement la fraction A dénuée de pouvoir réducteur) et exposées aux différents stress. La fluorescence est mesurée au fluorimètre avec des longueurs d’ondes d’excitation de 485 nm et d’émission de 530 nm.
Test de survie à la phagocytose par les RAW 264.7 : Dans le cadre de ce test, les cellules
sont cultivées dans du milieu DMEM supplémenté avec 10 % de sérum de veau fœtal. Une fois à 80% de confluence, ces dernières sont privées de sérum (et pour certaines supplémentées en CuCl2 20 µM) durant 12 heures. Par la suite, les cellules sont détachées avec un « cell scraper » , dénombrées et réparties à environ 1.8 millions par puits (plaques 6 puits). Ensuite du LPS de E. coli est ajouté à 500 µg/ml dans certains puits. En parallèle les bactéries sont cultivées sur BG+sang durant 36 heures et resuspendues dans du PBS pour la mise en contact avec les macrophages durant trente minutes. Les cellules sont ensuite lavées avec du PBS, puis du milieu frais est ajouté contenant 100 µg/ml de polymixine B pour éliminer les bactéries extracellulaires (cette partie du protocole a été modifiée pour la plupart des autres expériences : voir protocole de l’article). Enfin, aux temps voulus les cellules sont lavées avec du PBS puis lysées avec de la saponine (0.1%) de manière à récupérer les bactéries vivantes qui seront diluées et étalées sur boîte pour être dénombrées.
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Test de survie à la phagocytose par les THP1 : Dans le cas des infections de THP1 réalisées
dans les résultats complémentaires, les cellules ont été cultivées dans du milieu RPMI + SVF 10%. Les cellules sont ensuite lavées et resuspendues dans du RPMI sans SVF (et certaines supplémentés en CuCl2 20 µM). 1.8 millions de cellules sont placées en plaques 6 puits. 50 ng/ml de PMA sont ajoutés durant 24 heures. Avant infection, les cellules sont lavées pour éliminer le PMA. La suite du protocole est similaire à celui décrit dans l’article.
Colonisation animale : Dans le cas de la colonisation animale sur 21 jours, il est possible de
lire le protocole dans l’article concerné. Dans le cas de la seconde colonisation animale, les souris ont été vaccinées avec 1/10 de la dose humaine du vaccin Infanrix en injection sous-cutanée. Les souris Balb/c ont reçu deux doses de ce vaccin, respectivement 60 et 30 jours avant l’infection. Le reste du protocole est similaire à celui décrit précédemment à ceci près que la période de suivi s’est étalée sur 49 jours.
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