Régulation de l’expression des DEFA1-3 dans les neutrophiles dérivés des

des cellules HL-60

III.1.2.1. Effet du glucose

L’identification de la lignée cellulaire exprimant les DEFA1-3 et sa différenciation en

neutrophiles nous ont permis d'étudier l’effet du glucose sur l'expression des gènes DEFA1-3.

Les neutrophiles dérivés des cellules HL-60 en culture ont été traités avec les concentrations

de 4,5 mM et 10 mM de glucose pendant 6 h. Cette durée de traitement simule l'étape

post-prandiale de l'organisme humain, caractérisée par la présence de taux élevés de glucose dans

la circulation. Nous avons montré que le traitement des neutrophiles HL-60 avec 10 mM de

glucose pendant 6 h a provoqué une diminution significative du taux d'expression des ARNm

des DEFA1-3 par comparaison au contrôle (p < 0,001) (Figure 48). Les cellules en culture

étant en carence d’insuline, le transport de glucose dans les cellules pourrait être lent. Afin de

vérifier cette hypothèse nous avons ajouté de l’insuline dans le milieu de culture des cellules

traitées par du glucose.

149

Figure 48 : Régulation de l’expression des ARNm des DEFA1-3 dans les neutrophiles

dérivés des cellules HL-60 par le glucose ou/et l’insuline. Les neutrophiles ont été traités

pendant 6 h avec les concentrations indiquées. Les ARNm des DEFA1-3 sont quantifiés par

RT-PCR semi-quantitative. Les résultats présentés sont la moyenne d’expression des

DEFA1-3 de deux expériences, exprimée en rapport d’ARNm DEFA1-3/18S (moyenne ±

écart type). * p = 0,08 ; ** p < 0,05 ; *** p = 0.001 ; Test t Student.

III.1.2.2. Effet du glucose en présence d’insuline sur l’expression des DEFA1-3

Après traitement des cellules avec le glucose en présence cette fois-ci de 150 nM

d’insuline, l'analyse de l’expression des DEFA1-3 a montré que l’ajout de l’insuline a un effet

inverse par rapport à celui du glucose sur l’expression des DEFA1-3 dans les neutrophiles

HL-60. Nous avons observé une augmentation d’environ 2 fois dans l’expression des ARNm

des DEFA1-3 dans les cellules cultivées en présence d’insuline par comparaison aux cellules

cultivées dans les conditions d’hyperglycémie uniquement (p < 0,05) (Figure 48). Nous

démontrons ainsi une régulation in vitro des gènes DEFA1-3 par le glucose et l’insuline dans

les neutrophiles dérivés des cellules HL-60.

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1

1.1

A

R

N

m

D

E

F

A

1

-3

/1

8

S

(

U

A

)

Glucose 4,5 mM - + - - + -

Glucose 10 mM - - + - - +

Insuline 150 nM - - - + + +

**

**

***

*

**

150

III.1.3. Discussion

Les cellules HL-60 sont des pro-myélocytes leucémiques qui expriment les DEFA1-3

(Daher et coll., 1988). De plus, ces cellules peuvent être spécifiquement différenciées en

neutrophiles ou en macrophages matures en les cultivant en présence de composés spécifiques

(Fischkoff et Condon., 1985). Contrairement aux lymphocytes B, les neutrophiles et les

macrophages sont présents en quantités abondantes dans les lésions d’athérosclérose où ils

contribuent aux différents stades de développement des plaques d’athérosclérose. Ces cellules

produisent de fortes concentrations de chimiokines, de cytokines pro-inflammatoires, et de

nombreuses substances à activité antimicrobienne comme les métallo-protéases et la

lipoprotéine-phospholipase A2 (Libby, 2002 ; Mohler et coll., 2008).

Dans la présente étude, nous avons montré que la différenciation des cellules HL-60

en neutrophiles en utilisant le DMSO ne semble pas affecter l’expression des gènes DEFA1-3.

Par ailleurs, la différenciation de ces cellules en macrophages, induite par le PMA, semble

inhiber l’expression des DEFA1-3. Ces résultats sont en accord avec ceux obtenus par Herwig

et coll. (1996), suggérant que la transcription des défensines est spécifique à la voie de

différenciation granulocytaire des pro-myélocytes. Le modèle des neutrophiles dérivés des

cellules HL-60 pourrait donc être considéré comme étant le type leucocytaire d’intérêt pour

étudier l'éventuelle régulation des gènes DEFA1-3 dans le contexte de l’inflammation et des

altérations métaboliques.

Afin de comprendre la relation que nous avons observé entre le taux de glucose

circulant et le niveau d’expression des DEFA1-3 dans les PBMCs des sujets de la cohorte

STANISLAS, nous avons analysé l’effet de traitement par le glucose sur l’expression des

DEFA1-3 dans les neutrophiles dérivés des cellules HL-60 in vitro. Les résultats de ces études

montrent que le glucose provoque une diminution significative de l'expression des ARNm des

DEFA1-3 dans les neutrophiles. Cette diminution est restaurée lorsque l’insuline est ajoutée

dans le milieu de culture. L’expression des DEFA1-3 est significativement augmentée par la

combinaison du glucose et de l’insuline dans le milieu de culture. Ces observations suggèrent

l’existence d’un lien entre l’expression des DEFA1-3 et le métabolisme du glucose et les

voies de signalisation d’insuline. Ces résultats confirment bien la corrélation observée entre

l’expression des DEFA1-3 et la glycémie auprès des sujets de la cohorte STANISLAS

(étudiés dans la section I). Nos résultats sont en accord avec deux études réalisées sur les

151

défensines-β chez des animaux diabétiques. Hiratsuka et coll. (2001) ont démontré une

diminution de l’expression de la défensine-β1 dans les reins de rongeurs diabétiques. Une

étude plus récente a montré que l’expression de la défensine-β1 et d’autres éléments du

système immunitaire inné comme le TLR-2 et -4 dans les reins de rats diabétiques était

réprimée par une hyperglycémie, mais cette répression peut être inversée par un traitement à

l’insuline (Froy et coll., 2007). Cependant, des résultats contradictoires ont été rapportés

récemment par ces mêmes auteurs (Barnea et coll., 2008) et par Malik et Al-Kafaji (2007),

montrant une induction de l’expression des transcrits de la défensine-β1 par le glucose dans

des cellules rénales humaines et murines, contrairement à ce qui a été observé in vivo.

Toutefois, l’ensemble de ces études s’accorde avec la nôtre sur le fait que l’insuline, en

présence de taux anormalement élevés de glucose, induit l’expression des défensines aussi

bien in vivo que in vitro et laisse postuler que la signalisation par l’insuline modulerait

l’expression des défensines.

Bien qu’un effet du glucose et d’insuline sur l’expression de la défensine-β1 soit

largement documenté dans des cellules rénales, nos études préliminaires montrent pour la

première fois que le glucose ou/et l’insuline pourrait réguler l’expression des défensines-α

dans les neutrophiles. Nos résultats sont confortés par l’étude de Walrand et coll. (2004) qui

ont mis en évidence le rôle de l’insuline dans la régulation des fonctions des neutrophiles in

vivo. Ces auteurs ont montré que l’insuline amplifie l’activité chimiotactique, la phagocytose

et les capacités bactéricides des neutrophiles chez des hommes supposés sains. Par ailleurs, le

mécanisme par lequel les voies de signalisation de glucose et d’insuline affecteraient

l’expression des défensines reste à déterminer.

152

III.2. Etude de la régulation de l’expression de la cathélicidine de souris

Dans le document Peptides antimicrobiens : un lien entre l'immuno-inflammation et les facteurs de risque du syndrome métabolique et des maladies cardiovasculaires (Page 170-174)