Analyse transcriptionnelle des gènes des DEFA1-3 et de CRAMP

II.7.1. Extraction et contrôle de qualité des ARN

II.7.1.1. Principe de la technique

La technique d’extraction utilisée est basée sur le principe d’adsorption spécifique des

acides nucléiques sur une matrice de silice dans des colonnes de purification (Qiagen). Elle

est proposée dans le kit RNeasy mini de Qiagen®. Après lyse des cellules et

homogénéisation, l’homogénat est déposé sur une colonne de purification. L’ARN total est

retenu sur la membrane de silice de la colonne, alors que les autres constituants se trouvant

dans l’échantillon sont éliminés par des lavages successifs. Enfin, les ARN sont élués par un

volume d’eau dépourvue de ribonucléases (RNases).

II.7.1.2. Protocole

Les cellules cultivées sont récupérées directement dans du PBS 1X (Invitrogen) à

raison de 0,5 mL/puits dans des tubes eppendorf de 2 mL. L’ARN total est extrait à l’aide du

kit RNeasy mini (Qiagen) en utilisant le protocole dédié aux cellules d’origine animale.

Toutes les manipulations sont réalisées dans la glace. La lyse des cellules est réalisée en

ajoutant au tampon de lyse du β-mercaptoéthanol (99:1, v/v). Ce dernier permet l’inactivation

des éventuelles RNases présentes dans l’échantillon. Les ARN retenus sur la colonne

d’extraction sont traités avec une solution de DNase I afin d’éliminer l’éventuelle

contamination en ADN génomique. L’ARN total est élué dans 50 µl d’H2O stérile dépourvue

de RNases.

Le dosage et la vérification de la pureté de l’ARN sont effectués par mesure des

absorbances aux longueurs d’onde 260 nm et 280 nm. L’ARN n’est pas ou peu contaminé par

des protéines si le rapport absorbance à 260 nm / absorbance à 280 nm est compris entre 1,8 et

2,1. L’absorbance à 260 nm permet de connaître la concentration d’ARN. Sachant qu’une

unité d’absorbance à 260 nm correspond à 40 ng/µL :

96

L’intégrité de l’ARN est confirmée par une électrophorèse en gel d’agarose en

conditions dénaturantes (formaldéhyde). La visualisation de deux bandes distinctes

correspondant aux ARN ribosomaux 28S et 18S avec un rapport d’intensité des bandes de 2 :

1 est la preuve de la bonne qualité de l’ARN.

II.7.2. Quantification des peptides antimicrobiens par RT-PCR

semi-quantitative

Les taux d’expression des gènes des peptides antimicrobiens (DEFA1-3 et CRAMP) et

des marqueurs de différenciation cellulaire (CD11b et CD14) sont déterminés par RT-PCR

semi-quantitative. L’expression des ARNm des DEFA1-3 et de CRAMP est normalisée sur

les gènes de référence18S et β-actine, respectivement.

II.7.2.1. Transcription inverse (RT)

Pour une réaction de RT, 200 ng d’ARN total provenant des cellules U-937 ou HL-60,

ou 300 ng d’ARN total provenant des cellules 3T3-L1 sont utilisés. La synthèse d’ADNc

simple brin s’effectue selon le protocole suivant : les ARN sont mélangés à 0,25 µg d’Oligo

(dT)15 (Promega®, Charbonni, France) (soit 0.5 µL) et 1X de tampon RT (Promega®) (soit 4

µL) dans un volume de 13,5 µL, ajusté avec de l’eau déporvue de RNases. Après 5 min

d’incubation à 65°C dans le thermocycleur (I-Cycler®, Biorad), le mélange est placé dans de

la glace, puis, 2 mM de dNTP (Promega®), 20 unités d’inhibiteur de RNases (RNasine)

(Promega®) et 200 unités d’enzyme de reverse transcription (Moloney Murine Leukemia

Virus reverse transcriptase) (Promega®) sont ajoutées. Le volume final est ajusté à 20 µL

avec de l’eau dépourvue de RNases, puis incubé à 42°C pendant 60 min pour la synthèse de

l’ADN complémentaire. L’ADNc obtenu est ensuite soumis à des PCR semi-quantitatives.

Des témoins de RT et de PCR sont effectués.

II.7.2.2. PCR semi-quantitative

La PCR est appelée semi-quantitative car le résultat de quantification est exprimé par

le rapport entre l’intensité de la bande correspondant au gène d’intérêt et celle correspondant

au gène de référence, aussi dit domestique, en l’occurrence le 18S humain et la β-actine de

souris. Les PCR des gènes étudiés ont été réalisées dans des conditions non saturantes

déterminées préalablement (Tableau 5).

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La PCR semi-quantitative est réalisée à l’aide d’un appareil I-Cycler® (Biorad). 50 µL

de mélange réactionnel de PCR inclus le tampon de la Taq polymérase à concentration 1X

(Roche), 200 µM de dNTPs (Roche), 0,20 à 0,50 µM (Tableau 5) de chacun des

oligonucléotides amorces spécifiques (Sigma), 1 unité de Taq DNA polymérase (Roche) et 2

µL d’ADNc. Les paramètres d’amplification sont les suivants : après un cycle de dénaturation

initiale à 95°C pendant 4 min, 30 cycles d’amplification sont réalisés chacun est effectué

ainsi : séparation des brins à 95°C pendant 30 sec, hybridation à 60,4°C pendant 30 sec,

élongation à 72°C pendant 30 sec. Un cycle d’élongation finale est réalisé à 72°C pendant 5

min. Les séquences des oligonucléotides amorces utilisées et les conditions de PCR pour les

gènes codant les DEFA1-3, LL-37, CRAMP, 18S, CD14, CD11b et β-actine sont présentées

dans le Tableau 5.

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Tableau 5 : Séquences d’oligonucléotides et conditions d’amplification des gènes étudiés par RT-PCR semi-quantitative.

Gènes Séquences des amorces ^Amorces _(µM) ^{Dénaturation} _(°C/sec) ^Hybridation _(°C/sec) ^Elongation _{(°C/sec) de cycles} ^Nombre l’amplicon ^{Taille de}

(pb)

LL-37 ^{Sens :} _{Antisens :} ^{5’- CTC GGA TGC TAA CCT CT- 3’} _{5’-CAT ACA CCG CTT CAC C-3’} 0,50 95/30 62,3/60 72/60 35 178

DEFA1-3 ^{Sens :} _{Antisens :} ^{5’- GCG GAC ATC CCA GAA GTG GTT G - 3’} _{5’-TCA GCA GCA GAA TGC CCA GAG TC - 3’} 0,50 95/30 63/30 72/30 30 174

CRAMP ^{Sens :} _{Antisens :} ^{5’-CCGAGCTGTGGATGACTTCAA-3’} _{5’-CTG CCC CCA TAC ACT GCT TCA C-3’} 0,25 95/30 60,4/30 72/30 35 215

B-actine ^{Sens :} _{Antisens :} ^{5'-AGC CAT GTA CGT AGC CAT CC-3'} _{5'-TCC CTC TCA GCT GTG GTG GTG AA-3'} 0,20 95/30 60,4/30 72/30 35 231

18s ^{Sens :} _{Antisens :} ^{5’-TAT GGT TCC TTT GGT CGC TC-3’} _{5’-CTT GGA TGT GGT AGC CGT TT-3’} 0,40 95/30 62,3/60 72/60 35 153

CD14 ^{Sens :} _{Antisens :} ^{5’-ACT CCC TCA ATC TGT CGT TCG CTG-3’} _{5’-CTG AAG CCA AGC AGT TTG AGT CC-3’} 0,50 95/30 63°C/60 72/60 30 250

99

II.7.2.3. Electrophorèse et quantification

La quantification se traduit par la mesure de l’intensité des bandes d’ADN amplifié,

obtenues après électrophorèse et révélation sur gel de polyacrylamide. Le polyacrylamide

forme un maillage. Sous un courant électrique, les fragments d’ADN migrent au travers du

réseau de polyacrylamide, du négatif vers le positif en fonction de leurs tailles. Ces fragments

sont ensuite révélés sous une lumière UV (ultraviolet) par mise en présence de bromure

d’éthidium, un intercalant de l’ADN qui émet une fluorescence sous UV.

Le gel utilisé dans ce travail est un gel à 10% d’acrylamide composé de : 3,15 mL

d’eau, 1,125 mL d’acrylamide à 40% (Sigma), 450 µL de tampon TBE (Tris-Borate-EDTA)

(Merk), 45 µL de persulfate d’ammonium à 10% (Quantum biotachnologies) et 4,5 µL de

TEMED (NNN’N’-Tétra Méthyl Etthylène Diamine) (Bioprobe). Une fois le gel polymérisé,

8 µL d’échantillon de PCR mélangés à 1,6 µL de tampon de charge sont déposés (Promega,

6X) (excepté pour 18S et β-actine : respectivement 5 µL et 1 µL). Un marqueur de taille

(ɸX174/Hinf I, Promega) est aussi déposé sur un puits du gel. La migration est effectuée à

70V, entre 70 et 90 minutes selon la taille des fragments d’ADN à séparer. Le gel est ensuite

incubé dans un bain de 50 mL d’eau en présence de 5 µL de bromure d’éthidium (Sigma)

pendant 10 minutes. Sous UV, une photo du profil d’électrophorèse sur gel est prise à l’aide

d’un appareil photo numérique (Kodak EDAS) (Figure 35). L’analyse et l’estimation de

l’intensité des bandes d’intérêt sont réalisées au moyen du logiciel Kodak 1 D 3.5. (Kodak

EDAS).

Figure 35 :Profil d’électrophorèse des produits de PCR de DEFA1-3

sur gel de polyacrylamide à 10 %.

M : marqueur de taille de fragments d’ADN

1, 2 : produits de PCR de DEFA1-3 (174 pb)

T- : témoin négatif

T- 1 2 _M

174 pb

(DEFA1-3)

100

Dans le document Peptides antimicrobiens : un lien entre l'immuno-inflammation et les facteurs de risque du syndrome métabolique et des maladies cardiovasculaires (Page 117-122)