Quantification de l’expression des gènes par RT-PCR en temps réel

I.4.3.1. Principe de la technique de quantification

Cette technique a été appliquée pour évaluer l’expression des ARNm de LL-37,

DEFA1-3 et du récepteur FPR dans les PBMCs. Le principe consiste, après transcription

inverse d’une quantité donnée d’ARN, à amplifier l’ADNc obtenu et à détecter en temps réel

la fluorescence émise au fur et à mesure de la formation de l’ADN double brin dans lequel

s’insère un agent intercalant fluorescent (le SYBRGreen dans notre technique). La

fluorescence émise est proportionnelle à la quantité d’ADN amplifié. Ce dernier est alors

détecté en temps réel par mesure de l’augmentation de la fluorescence du SYBR Green se

liant à l’ADN double brin. La quantité d’ADNc initialement présente dans l’échantillon

analysé est déterminée de manière absolue grâce à une gamme de dilutions de standards à

concentration connue.

I.4.3.2. Protocole de quantification

Après extraction des ARN et transcription inverse en ADNc tel que décrit ci-dessus, la

quantification des transcrits des gènes d’intérêt est réalisée suivant trois étapes :

 Mise au point des conditions de PCR en temps réel pour le gène à quantifier

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 Quantification du gène d’intérêt dans les échantillons analysés

Nous présentons le protocole de quantification en prenant l’exemple du gène de LL-37.

a) Mise au point des conditions de PCR en temps réel pour le gène de LL-37

Un couple d’amorces sens et anti-sens permettant d’amplifier une partie du gène de

LL-37 est utilisé. Les séquences d’amorces ont été dessinées à l’aide du logiciel Primer

Premier 5.0 de Biosoft International.

Le fragment de 178 pb est amplifié avec le Kit 1X LightCycler FastStart DNA Master Plus

SYBR Green I dans le LightCycler (Roche Diagnostics) selon les conditions suivantes :

Mélange réactionnel ^Volume/ _capillaire ^{Concentration} _finale

Amorce sens 4 µL 1 µM

Amorce antisens 4 µL 1 µM

Master Mix 4 µL

H2O 3 µL

ADNc 5 µL 1,25 ng/µL

Volume total (qsp) 20 µL

Cycles de température

35 cycles Dénaturation 95°C – 10 sec

Hybridation 61°C – 10 sec

Elongation 72°C – 7 sec

L’amplification par PCR est suivie d’une phase d’analyse des amplicons obtenus.

Cette phase se caractérise par une augmentation progressive de la température du LightCycler

donnant ainsi la courbe de fusion du produit de PCR. Cette courbe de fusion (Figure 29)

permet de confirmer l’amplification spécifique du seul fragment d’intérêt, caractérisé par un

seul pic et une même température de fusion (Tm) dans tous les échantillons analysés. La

cassure de la pente (A) et la présence d’un seul pic (B) atteste de l’amplification d’un seul

fragment (Figure 29). La fluorescence enregistrée diminue progressivement avec

l’augmentation de la température pour chuter brutalement à une température spécifique du

fragment d’intérêt, à laquelle 50% de l’ADN synthétisé est dénaturé (Tm). Cela permet donc

Amorces sens : 5’-CTC GGA TGC TAA CCT CT-3’

Amorces anti-sens : 5’-CAT ACA CCG CTT CAC C-3’

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d’identifier le fragment amplifié pour lequel la température de fusion ainsi déterminée est

spécifique. Le produit de PCR est enfin déposé sur gel d’acrylamide 10% pour confirmer

l’obtention d’un seul fragment et pour s’assurer que sa taille corresponde bien à celle du

fragment d’intérêt.

Figure 29 :Courbe de fusion

b) Constitution de la gamme de copies (gamme étalon) du gène de LL-37

Il s’agit de constituer une gamme de copies d’ADN de LL-37 par série de dilutions des

produits de PCR correspondants. Le fragment du gène de LL-37 (178 pb) est amplifié par

PCR en temps réel selon les conditions optimisées et le principe décrit ci-dessus. Les produits

de PCR sont ensuite purifiés sur colonnes Qiagen (QIAquik PCR Purification Kit) et dosés

par spectrophotométrie.

Sachant qu’1 unité de densité optique (DO) à 260 nm ≈ 50 ng/µL d’ADN :

Concentration d’ADN (ng/µL) = DO (260 nm) de la dilution x facteur de dilution x 50

L’équivalent en nombre de copies est ensuite déterminé à partir de la concentration

d’ADN suivant la formule ci-dessous.

A

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1 mole = 6 x 1023 molécules (copies)

Masse moléculaire (g/mol) = nombre de paires de bases x 660 daltons

Nombre de copies par µL = 6 x 10²³ (copies/mol) x concentration [g/µL]

Masse Moléculaire [g/mol]

La gamme de copies d’ADN est ensuite constituée par dilutions en cascade (au 10^ème)

de l’ADN purifié et dosé, puis testée sur l’appareil de PCR en temps réel afin de générer la

courbe étalon (Figure 30). Chaque dilution au 10ème correspond à une différence de 3,3

cycles. La gamme étalon est comprise généralement entre 10 et 108 copies du fragment

d’ADN d’intérêt. La pente de la courbe étalon est déterminée automatiquement par le logiciel

de LightCycler et permet de s’assurer de la qualité de la gamme et de l’efficacité de la PCR.

L’efficacité (E) de la PCR est calculée par la formule suivante : E = 10(-1/pente) – 1

Figure 30 : Gamme étalon et droite de régression linéaire.

Cette gamme est ensuite insérée dans chaque série de PCR pour déterminer le nombre de

copies dans chaque échantillon analysé.

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c) Quantification du gène d’intérêt dans les échantillons analysés

La quantification du gène d’intérêt peut ainsi se faire par amplification simultanée

d’une quantité inconnue d’ADNc du gène d’intérêt avec les différents points de la gamme

étalon pour lesquels le nombre de copies est connu. Chaque échantillon à analyser est traité en

dupliquat en utilisant une quantité constante d’ADNc, 25 ng. Les échantillons sont amplifiés

par PCR avec le LightCycler FastStart DNA Master Plus SYBR Green I kit dans le

thermocycleur LightCycler selon les conditions optimisées et le même principe que pour

l’établissement de la gamme. La gamme étalon est testée en parallèle. Des témoins (positifs et

négatifs) de PCR sont également inclus.

La formation des produits de PCR à chaque cycle d’amplification est représentée par

des courbes de quantification (Figure 31) où le nombre de copie est fonction du nombre de

cycles. Chaque point d’inflexion des courbes correspond au Ct propre de chaque réaction et

représente le cycle du seuil de détection (Cycle Threshold) de l’échantillon. Ce Ct est

inversement proportionnel à la quantité d’ADN initial. Le nombre de copies correspondant au

fragment du gène d’intérêt est alors calculé par le logiciel LightCycler à partir de la régression

linéaire de la droite de calibration.

Figure 31 :Courbe de quantification.

Cette technique de quantification d’expression des gènes est aussi appliquée pour

l’analyse des gènes suivants : DEFA1-3 et FPR1. Ci-après sont présentées les conditions

d’amplification de ces gènes après mise au point.

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Conditions d’amplification par PCR en temps réel

Gènes DEFA1-3

Amorce sens : 5’-GCG GAC ATC CCA GAA GTG GTT G-3’

Amorce anti-sens : 5’-TCA GCA GCA GAA TGC CCA GAG TC-3’

Taille de l’amplicon : 174 pb

Mélange réactionnel Volume/

capillaire ^{Concentration} finale

Amorce sens 2 µL 0,5 µM

Amorce antisens 2 µL 0,5 µM

Master Mix 4 µL

H2O 7 µL

ADNc 5 µL 1,25 ng/µL

Volume total (qsp) 20 µL

Cycles de température

35 cycles Dénaturation 95°C – 10 sec

Hybridation 58°C – 10 sec

Elongation 72°C – 7 sec

Gène FPR1

Amorce sens 5’-TGG ACC AAC GAC CCT AA-3’

Amorce anti-sens 5’-AAG GCT GCT GCG ACA A-3’

Taille de l’amplicon 203 pb

Mélange réactionnel ^Volume/ _capillaire ^{Concentration} _finale

Amorce sens 2µL 0,5 µM

Amorce antisens 2µL 0,5 µM

Master Mix 4µL

H2O 7 µl

ADNc 5 µL 1,25 ng/µL

Volume total (qsp) 20 µl

Cycles de température

35 cycles Dénaturatio 95°C – 10 sec

Hybridation 59°C – 10 sec

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Dans le document Peptides antimicrobiens : un lien entre l'immuno-inflammation et les facteurs de risque du syndrome métabolique et des maladies cardiovasculaires (Page 98-104)