Analyse de l’expression des protéines

I.3.1. Dosage des protéines totales contenues dans les PBMCs

Nous avons procédé à l’extraction, puis au dosage des protéines totales des cellules

mononuclées du sang périphérique (PBMCs) en utilisant les méthodes qui suivent.

I.3.1.1. Extraction des protéines

Dans un premier temps, les PBMCs ont été isolées à partir des tubes de sang avec

héparinate de sodium.

Principe

Les éléments figurés du sang, déposés sur une solution de ficoll de haute densité,

subissent durant une centrifugation une migration différentielle qui conduit à leur séparation

en fonction de la densité. Les érythrocytes et les granulocytes sédimentent au fond du tube et

les cellules mononuclées forment un anneau à l’interface entre le plasma et le ficoll.

Réactifs

 Milieu de Hanks (Hanks’Balanced Solution Salt, SIGMA)

 Solution de ficoll (Ficoll paqueTM plus, Amersham BioSciences)

Protocole

 Dans un tube de 15 mL, ajouter du milieu de Hanks (v/v) au sang

 Verser le mélange dans un tube de 15 mL contenant le même volume de ficoll

 Centrifuger 30 min, à 300 g, à T° ambiante (sans frein)

 Récupérer l’anneau de cellules mononuclées dans un tube de 15 mL

 Compléter avec du milieu de Hanks, bien resuspendre par retournement

 Centrifuger à 1000 g, pendant 10 min à T° ambiante (1^er lavage)

 Aspirer le surnageant et compléter à 2 mL avec du milieu de Hanks et bien

resuspendre

 Prélever 50 µL pour comptage des cellules, puis compléter à 14 mL, bien

resuspendre

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 Centrifuger à 1000 g, pendant 10 min à T° ambiante (2ème lavage)

 Récupérer le culot dans un 1 mL de milieu de Hanks et transférer dans un tube

eppendorf

 Centrifuger à 1000 g, pendant 5 min à T° ambiante

 Aspirer le surnageant

 Ce culot est traité immédiatement pour extraction des protéines totales

Dans un second temps, l’extraction des protéines totales des PBMCs a été réalisée.

Réactifs

 Tampon de lyse cellulaire (Ceel lyticTM –M, SIGMA)

 Inhibiteur de protéases (Protease Inhibitor Cocktail, SIGMA)

Protocole

 Préparer la solution de lyse : 320 µL de tampon de lyse par échantillon si le

nombre de cellules > 106 (160 µL de tampon de lyse si nombre de cellules < 106)

additionnés de 1,6 µL d’inhibiteur de protéases (0,5% V/V)

 Ajouter la solution de lyse au culot de cellules, bien resuspendre

 Mettre sous agitation pendant 15 min à T° ambiante

 Centrifuger à 12000 g pendant 15 min à 4°C

 Récupérer le surnageant, puis l’aliquoter

 Stocker les aliquots à -80°C.

I.3.1.2. Dosage des protéines totales

Principe

La méthode de l’acide bicinchoninique « BC Assay » (Uptima, Interchim) est un test

colorimétrique qui repose sur le principe de réduction des ions Cu2+ en Cu+ par les liaisons

peptidiques des protéines. Le BC Assay (acide bicinchoninique) chélate les ions Cu+ avec une

très forte spécificité pour former un complexe soluble coloré en violet.

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Ponts peptidiques + Cu2+ [Complexe tetradente- Cu+]

OH

-Cu⁺ + 2BC [Complexe Cu⁺-BC violet]

La réaction est mesurée par l’absorbance du complexe Cu⁺ final à 562 nm.

Préparation des réactifs

 Réactif BC Assay : 1 volume du réactif B est additionné à 50 volumes du réactif A

 Une gamme de standard (BSA, Bovine Serum Albumin) de 20 µg/mL à 2 mg/mL

(8 points) est préparée dans le tampon de dilution des échantillons.

Protocole

 Déposer 25 µL de chaque standard (en double), contrôle (en double) et

échantillons dans des puits de microplaque de 96 puits

 Ajouter 200 µL de réactif BC Assay par puits et mélanger

 Incuber à 37°C pendant 30 min

 Ramener la microplaque à température ambiante et mesurer l’absorbance à 562

nm

La lecture des absorbances à 562 nm est effectuée sur un lecteur de microplaques

Benchmark Plus (Bio-Rad Laboratories, Inc.). La courbe standard est obtenue par régression

linéaire (logiciel Microplate Manager 5.2, Bio-Rad Laboratories, Inc.).

La concentration des protéines dans les échantillons est ainsi déterminée à partir de la courbe

standard.

I.3.2. Dosage de LL-37

Le dosage du peptide LL-37 a été réalisé dans des échantillons d’extraits protéiques de

PBMCs et de plasma provenant de 21 sujets supposés sains et sélectionnés de l’Etablissement

Français du Sang de Vandœuvre-lès-Nancy.

I.3.2.1. Principe de la méthodede dosage

La méthode de dosage repose sur une technique immunoenzymatique quantitative de

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anticorps monoclonaux spécifiques aux peptides LL-37 sont pré-déposés au fond de chacun

des puits de la microplaque. Les échantillons à quantifier, les standards et le contrôle sont

déposés dans les puits de la microplaque et les molécules d’intérêt présentes sont fixées par

l’anticorps immobilisé. La présence de LL-37 est révélée à l’aide d’un second anticorps

biotynilé spécifique et l’ajout du conjugué Streptavidine-peroxydase qui réagit spécifiquement

avec l’anticorps biotynilé fixé sur la molécule d’intérêt. Des lavages successifs permettent

d’éliminer les substances non liées et un substrat de la peroxydase, le

3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine (TMB) est ajouté. La coloration qui en résulte est proportionnelle à la

quantité de molécule de LL-37 fixée. Après ajout d’une solution d’acide citrique qui

neutralise la réaction enzymatique, l’intensité colorimétrique est déterminée par la mesure de

l’absorbance à 450 nm par spectrophotométrie.

I.3.2.2. Protocole de dosage

Préparation des réactifs

Les réactifs utilisés proviennent d’un kit commercialisé et les solutions de travail sont

préparées suivant les instructions du fournisseur (Hycult Biotechnology, France).

 Reconstitution des standards : pour chaque plaque de 96 puits, un flacon de

standard lyophilisé est reconstitué avec 0,5 mL d’eau ultra pure.

 Préparation du tampon de lavage/dilution : 20 mL de la solution A (phosphate

buffered saline, Tween 20, 2-chloroacetamide (conservateur)) sont dilués dans 200

mL d’eau ultra pure. 10 mL de la solution B (MgCl2 et 2-chloroacetamide

(conservateur)) sont dilués dans 200 mL d’eau ultra pure. Les deux solutions

diluées sont ensuite mélangées (v/v).

 Reconstitution du second anticorps biotynilé : pour chaque plaque, un flacon du

second anticorps lyophilisé est reconstitué avec 1 mL d’eau ultra pure, puis 11 mL

du tampon de dilution sont ajoutés à la solution reconstituée.

 Reconstitution du conjugué : un flacon (streptavidine conjuguée à la peroxydase)

est reconstitué avec 1 mL d’eau ultra pure, puis 0,5 mL du conjugué dilué à 12 mL

dans du tampon de dilution.

 Préparation des échantillons et des standards : les standards sont préparés par

dilution du standard reconstitué dans du tampon de dilution. Les échantillons sont

également préparés dans du tampon de dilution.

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La lecture des absorbances à 450 nm s’effectue sur un lecteur de microplaques Benchmark

Plus (Bio-Rad Laboratories, Inc.).

Les limites de détection du dosage ELISA de LL-37 sont de 0,14 à 100 ng/mL.

Calcul des concentrations de LL-37

La courbe standard est obtenue par régression logistique à 4 paramètres à partir des

valeurs des standards (logiciel Microplate Manager 5.2, Bio-Rad Laboratories, Inc.) (Figure

28). La concentration de LL-37 dans les échantillons est ainsi déterminée à partir de la courbe

standard.

Figure 28 :Courbe standard pour le dosage de LL-37 par ELISA. La courbe standard est

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Dans le document Peptides antimicrobiens : un lien entre l'immuno-inflammation et les facteurs de risque du syndrome métabolique et des maladies cardiovasculaires (Page 92-97)